2018-08-14
蔗糖(tang)(tang)(tang)是(shi)植物中(zhong)(zhong)運輸(shu)的(de)糖(tang)(tang)(tang)，很(hen)容易被(bei)昆蟲(chong)吸收以(yi)滿足生理代謝(xie)的(de)需要。 BmSuc1是(shi)一種新型動物β-呋喃果糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)（β-FFase，EC 3.2.1.26）編碼(ma)基因，首先在(zai)家蠶Bombyx mori中(zhong)(zhong)克隆和(he)鑒定。推(tui)測BmSuc1通(tong)過(guo)有效水(shui)(shui)解(jie)(jie)從(cong)桑(sang)葉中(zhong)(zhong)吸收的(de)蔗糖(tang)(tang)(tang)在(zai)家蠶-桑(sang)椹酶(mei)適應系統中(zhong)(zhong)發(fa)揮重(zhong)要作用，但尚(shang)未被(bei)證明。在(zai)本文(wen)中(zhong)(zhong)，作者提供了(le)家蠶β-FFase的(de)功能分析。研究(jiu)發(fa)現蔗糖(tang)(tang)(tang)酶(mei)活性主要依賴于β-FFase而不是(shi)α-葡(pu)萄糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)來水(shui)(shui)解(jie)(jie)蔗糖(tang)(tang)(tang)并產(chan)生葡(pu)萄糖(tang)(tang)(tang)和(he)果糖(tang)(tang)(tang)用于家蠶的(de)發(fa)育。使用針對(dui)BmSuc1的(de)短發(fa)夾RNA（shRNA）介導(dao)的(de)RNAi系統，發(fa)現幼(you)蟲(chong)中(zhong)(zhong)腸中(zhong)(zhong)蔗糖(tang)(tang)(tang)水(shui)(shui)解(jie)(jie)的(de)能力顯著(zhu)(zhu)降低，并觀察到(dao)異(yi)常(chang)表型，例如體積較(jiao)小，重(zhong)量較(jiao)輕和(he)發(fa)育遲(chi)緩。脂肪體中(zhong)(zhong)糖(tang)(tang)(tang)原儲存顯著(zhu)(zhu)減少。這些結果表明BmSuc1在(zai)家蠶的(de)糖(tang)(tang)(tang)代謝(xie)中(zhong)(zhong)作為必需的(de)β-FFase。
RNA-seq材料：兩組樣本，WT和(he)RNAi-BmSuc1
測序平臺：Illumina
1．BmSuc1的表(biao)達譜(pu)
為(wei)了確定BmSuc1的(de)階(jie)段和(he)(he)(he)組(zu)織特異性(xing)表(biao)達譜，通過RT-PCR和(he)(he)(he)qRT-PCR研(yan)究(jiu)了家蠶各階(jie)段不同(tong)組(zu)織中(zhong)(zhong)的(de)mRNA水(shui)平。BmSuc1在(zai)整(zheng)個(ge)幼蟲(chong)發育(yu)過程中(zhong)(zhong)表(biao)達，并且在(zai)5齡幼蟲(chong)中(zhong)(zhong)觀察到最大表(biao)達（圖1A和(he)(he)(he)B）。在(zai)組(zu)織中(zhong)(zhong)，BmSuc1在(zai)中(zhong)(zhong)腸和(he)(he)(he)絲腺的(de)前(qian)部(bu)和(he)(he)(he)中(zhong)(zhong)部(bu)表(biao)達。在(zai)其他組(zu)織中(zhong)(zhong)未檢(jian)測到BmSuc1 mRNA，包括脂肪(fang)體，頭部(bu)和(he)(he)(he)馬(ma)氏小管（圖1C和(he)(he)(he)D）。 這(zhe)些(xie)結果與先前(qian)報道的(de)一(yi)致，表(biao)明BmSuc1可能(neng)具(ju)有幼蟲(chong)消化(hua)和(he)(he)(he)絲腺發育(yu)的(de)功(gong)能(neng)。
圖1 BmSuc1在家(jia)蠶中的(de)表達
2．BmSUC1在蔗(zhe)糖水解中的(de)基本(ben)功能
蔗糖(tang)及其他(ta)糖(tang)的(de)酶(mei)活(huo)(huo)性檢測結果(guo)表明，家蠶β-FFase（即(ji)BmSuc1）具有水(shui)解和轉(zhuan)葡萄(tao)糖(tang)基(ji)化活(huo)(huo)性，且家蠶中蔗糖(tang)的(de)水(shui)解主要(yao)取(qu)決于β-FFase的(de)活(huo)(huo)性而(er)不依賴(lai)于α-葡萄(tao)糖(tang)苷(gan)酶(mei)，而(er)BmSuc1顯示出典(dian)型(xing)的(de)β-FFase特征。
3．shRNA介導的BmSuc1 RNAi
實驗構(gou)建(jian)了五個BmSuc1-PXL-U6-shRNA重組質粒并轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)染BmN細胞系(xi)以評(ping)估每(mei)種shRNA的效率。siRNA2抑制BmSuc1的轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄53％和(he)(he)蔗糖水解活性34％，因(yin)此被用于(yu)進一步分(fen)析(xi)。通(tong)過紅色(se)熒(ying)光的存在(zai)(zai)鑒定G1代中(zhong)(zhong)的陽(yang)性轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)卵（圖(tu)2A）。此外，DsRed2在(zai)(zai)整個幼體（圖(tu)2B）和(he)(he)幼蟲(chong)脂(zhi)肪體（圖(tu)2C），中(zhong)(zhong)腸（圖(tu)2D），前部絲腺（圖(tu)2E）和(he)(he)中(zhong)(zhong)部絲腺（圖(tu)2F）中(zhong)(zhong)表達強烈。選(xuan)擇(ze)兩個獨立的轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)家(jia)蠶品系(xi)，qRT-PCR和(he)(he)蛋白質印(yin)跡分(fen)析(xi)的結果表明，在(zai)(zai)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)家(jia)蠶幼蟲(chong)中(zhong)(zhong)，BmSuc1的表達在(zai)(zai)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄水平(ping)上(shang)和(he)(he)蛋白質水平(ping)上(shang)顯著下(xia)調（圖(tu)3）。
圖2用紅(hong)色熒光標記篩選RNAi - BmSuc1轉基因家蠶
圖(tu)3 qRT-PCR和western blot檢測轉基因家蠶中(zhong)BmSuc1的沉默效(xiao)果
4. RNAi-BmSuc1轉基因系(xi)中的異常表型
通(tong)過(guo)記(ji)錄所有齡(ling)期的(de)幼(you)(you)蟲(chong)體(ti)重，發現三齡(ling)幼(you)(you)蟲(chong)的(de)發育率存(cun)在明顯(xian)差異；表達RNAi-BmSuc1的(de)轉(zhuan)基因個體(ti)的(de)重量顯(xian)著低于WT（圖4A）。與(yu)(yu)WT相比(bi)，RNAi-BmSuc1幼(you)(you)蟲(chong)的(de)體(ti)尺一(yi)般也較(jiao)小（圖4B）。BmSuc1的(de)敲(qiao)除通(tong)過(guo)減小體(ti)重對家蠶幼(you)(you)蟲(chong)的(de)發育產生負面影(ying)響，其主要原因可能與(yu)(yu)減少脂(zhi)肪體(ti)量有關。
圖4 BmSuc1敲(qiao)除后幼蟲發育及異常表型
5. BmSuc1敲低后糖(tang)代謝的變化(hua)
為了表征BmSuc1敲(qiao)低對家蠶幼蟲糖分布的影響，作(zuo)者(zhe)分析(xi)了幼蟲中(zhong)腸(A)、血淋巴(ba)(B)、脂(zhi)肪體(C)中(zhong)主要二(er)糖酶活性(xing)的變化（圖5）。
圖5 BmSuc1敲除后幼(you)蟲中腸(A)、血淋巴(B)、脂(zhi)肪(fang)體(C)糖代謝變異(yi)模式
6. 轉(zhuan)錄(lu)組分(fen)析(xi)和糖代謝(xie)相(xiang)關基(ji)因(yin)的轉(zhuan)錄(lu)分(fen)析(xi)
為獲得關于家蠶總(zong)體糖(tang)(tang)(tang)代謝調節(jie)的(de)更多信息，在第3天第5齡(ling) RNAi-BmSuc1轉(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)系和(he)(he)WT幼蟲中(zhong)(zhong)(zhong)進行了中(zhong)(zhong)(zhong)腸的(de)轉(zhuan)錄組分(fen)析(xi)(xi)。總(zong)共(gong)在RNAi-BmSuc1系中(zhong)(zhong)(zhong)發現了202個差異基(ji)(ji)因(yin)，包(bao)括162個上調基(ji)(ji)因(yin)和(he)(he)40個下調基(ji)(ji)因(yin)。通(tong)過(guo)GO分(fen)類和(he)(he)通(tong)過(guo)KEGG分(fen)析(xi)(xi)的(de)DEGs作圖的(de)初步分(fen)析(xi)(xi)顯示，大量的(de)GO術(shu)語(yu)與糖(tang)(tang)(tang)代謝強烈(lie)相關，例如葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)，己糖(tang)(tang)(tang)和(he)(he)碳水化合物代謝（圖6）。這些(xie)結果(guo)表(biao)明，BmSuc1沉默(mo)導致中(zhong)(zhong)(zhong)腸中(zhong)(zhong)(zhong)糖(tang)(tang)(tang)代謝相關術(shu)語(yu)和(he)(he)基(ji)(ji)因(yin)的(de)大規模改變。
圖6 與糖(tang)代謝相(xiang)關的GO分析
參考文獻：
Q Gan et al. ?Biochim Biophys Acta (2018)
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影(ying)響(xiang)因子：5.108
轉(zhuan)錄調控(kong)事業部 王慧敏
2018年8月14日
