2018-09-04
2018年8月(yue)7日，派森諾生物與沈陽農業大學攜手合作，于Fish and Shellfish Immunology雜志上發表(biao)了(le)中華小長臂蝦感染(ran)中華急游水(shui)虱前后的(de)比較轉錄組分析的(de)研(yan)究成果《Comparative transcriptome analysis of Chinese grass shrimp (Palaemonetes sinensis) infected with isopod parasite Tachaea chinensis》，這是關于T. chinensis和P. sinensis之間的(de)寄生(sheng)蟲-宿主(zhu)相互作用(yong)的(de)轉錄組研(yan)究。
研究背(bei)景：
等足類寄生蟲廣泛分(fen)布于世界各地的(de)(de)海洋(yang)和淡水棲(qi)息(xi)地，它們(men)影響各種商(shang)業(ye)上重要的(de)(de)甲殼(ke)類動物和魚類。本文的(de)(de)研究(jiu)對象(xiang)，憑其引人注目的(de)(de)外觀和吸引人的(de)(de)味道成為重要的(de)(de)水族館和漁業(ye)資源的(de)(de)中(zhong)華小長臂蝦(Palaemonetes sinensis)，是等(deng)(deng)足(zu)類(lei)(lei)寄(ji)生蟲(chong)中(zhong)(zhong)華急(ji)游水虱（Tachaea chinensis）的(de)(de)宿主(zhu)。與大多數等(deng)(deng)足(zu)類(lei)(lei)寄(ji)生蟲(chong)不同，T.chinensis對(dui)低溫和(he)化學農(nong)藥(yao)具有很高的(de)(de)耐受性，特別是在集(ji)約化養殖設(she)施中(zhong)(zhong)，因此(ci)對(dui)蝦(xia)類(lei)(lei)的(de)(de)養殖影(ying)響較大。然而(er)，目前對(dui)等(deng)(deng)足(zu)類(lei)(lei)寄(ji)生蟲(chong)寄(ji)生和(he)宿主(zhu)反應的(de)(de)分(fen)子機制研究甚少，而(er)對(dui)于蝦(xia)類(lei)(lei)養殖中(zhong)(zhong)有效(xiao)的(de)(de)寄(ji)生蟲(chong)控制方法的(de)(de)開發，有關等(deng)(deng)足(zu)類(lei)(lei)寄(ji)生蟲(chong)感(gan)染機制的(de)(de)更多研究是必要(yao)的(de)(de)。
研究方法：
樣(yang)本：中華(hua)小長(chang)臂蝦兩(liang)組（對(dui)照組-正(zheng)常(chang)養殖，處理(li)組-養殖中加(jia)入(ru)中華(hua)急游水(shui)虱）
每組(zu)樣本為五(wu)個相同處(chu)理條(tiao)件樣本的(de)(de)RNA的(de)(de)等量混樣
平(ping)臺：Illumina HiSeq
研究結果：
1.測序和數據拼接的結果
從對照(zhao)組(zu)(zu)和感染組(zu)(zu)中產生了46,858,882和41,110,746條(tiao)clean reads。然后組(zu)(zu)裝了得到178,055個轉錄本和136,408個unigene，平均長度分別為268.06,635.53和530.89。高質量，長序列使得能夠收集關于(yu)相關基因(yin)的更多信息。。
2. 轉錄組注(zhu)釋結果(guo)
大約(yue)23.96％的(de)(de)unigene在一個(ge)或多個(ge)數據(ju)庫(ku)中(zhong)有注(zhu)(zhu)釋結(jie)果，所有數據(ju)庫(ku)都有注(zhu)(zhu)釋信息的(de)(de)比(bi)例為2.27％。NR庫(ku)的(de)(de)注(zhu)(zhu)釋結(jie)果中(zhong)，物種的(de)(de)注(zhu)(zhu)釋比(bi)例3%以上(shang)的(de)(de)為 Zootermopsis nevadensis 5.22％，Daphnia magna 4.07％，Limulus polyphemus 3.98％，Capitella teleta 3.12％，Lingula anatina 3.05％。
GO的(de)注釋(shi)(shi)(shi)結果(guo)可以看出，11,830個unigenes注釋(shi)(shi)(shi)到三個功能(neng)類(lei)中(zhong)。在第一類(lei)“生(sheng)物過(guo)程”中(zhong)，分別有4914, 1237和112個unigenes注釋(shi)(shi)(shi)到代謝過(guo)程，對刺(ci)激的(de)反應和免(mian)疫系(xi)(xi)(xi)統中(zhong)。KOG注釋(shi)(shi)(shi)的(de)的(de)結果(guo)將30158（22.11％）個Unigenes分成25組，KEGG注釋(shi)(shi)(shi)則(ze)表明，”生(sheng)物系(xi)(xi)(xi)統”中(zhong)前五個基因(yin)富集的(de)途徑是(shi)'內分泌(mi)系(xi)(xi)(xi)統（570; 5.40％），免(mian)疫系(xi)(xi)(xi)統（188; 3.47％），神經(jing)系(xi)(xi)(xi)統（176; 3.23％） ，消化系(xi)(xi)(xi)統（109; 2.01％）和發育（103; 1.90％）。
Figure 2. The GO annotation of assembled genes
Figure 3. The COG annotation of assembled genes
Figure 4. The KEGG annotation of assembled genes
3. 差異分析結果
在(zai)(zai)對照(zhao)組和感染(ran)(ran)組之間鑒定(ding)了1323個差(cha)異基(ji)因(yin)(yin)（DEG）（p <0.05），其中(zhong)702個在(zai)(zai)T.chinensis感染(ran)(ran)后上(shang)調(diao)，621個下(xia)調(diao)。KEGG和GO分析的(de)(de)結(jie)果(guo)表明“核糖(tang)體(ti)”是最富集(ji)(ji)的(de)(de)（69個DEG，在(zai)(zai)感染(ran)(ran)組中(zhong)68個上(shang)調(diao)）。這(zhe)種富集(ji)(ji)模式與(yu)導致核糖(tang)體(ti)相(xiang)關(guan)基(ji)因(yin)(yin)上(shang)調(diao)的(de)(de)細(xi)(xi)胞內寄生(sheng)蟲病（例如微(wei)孢子蟲感染(ran)(ran)）的(de)(de)觀察結(jie)果(guo)高度相(xiang)似。此(ci)外，細(xi)(xi)胞內寄生(sheng)蟲通常與(yu)宿主(zhu)細(xi)(xi)胞具有顯著不同的(de)(de)核苷酸(suan)(suan)代謝(xie)，從而改變宿主(zhu)代謝(xie)物(wu)水平。數據分析結(jie)果(guo)符合這(zhe)一潛在(zai)(zai)特征，寄生(sheng)后DEGs主(zhu)要富集(ji)(ji)在(zai)(zai)嘌呤代謝(xie)，氨基(ji)酸(suan)(suan)生(sheng)物(wu)合成(cheng)，嘧啶(ding)代謝(xie)，碳代謝(xie)和氧化磷酸(suan)(suan)化幾個途徑。
Figure 5. Volcano plot of differentially expressed genes (DEGs)
3.1 免疫相關差(cha)異基因
KEGG分析顯示上調(diao)或下(xia)調(diao)的DEG存在于8個“免(mian)疫(yi)系統”途徑(jing)中，但大多數途徑(jing)的富集不顯著(zhu)（p <0.05）。 此外，GO分析繪制了(le)三個富含“免(mian)疫(yi)系統過程”的DEG和兩(liang)個“免(mian)疫(yi)系統過程調(diao)節”（表S5）。 因此，為了(le)確保存活(huo)直至傳(chuan)播給下(xia)一(yi)個寄主(zhu)(zhu)，寄生(sheng)蟲如(ru)T. chinensis可(ke)能在避免(mian)宿主(zhu)(zhu)免(mian)疫(yi)反應，以(yi)及寄主(zhu)(zhu)對(dui)其他致死(si)性感(gan)染的易感(gan)性增加之間取得平衡。
3.2 代謝功能(neng)相關(guan)差異基因
在(zai)本研究中(zhong)，與(yu)三(san)羧酸(suan)（TCA）循環相關的(de)基(ji)因(yin)(yin)，包(bao)括谷(gu)氨酸(suan)脫(tuo)氫(qing)酶(mei)和(he)甘油醛(quan)3-磷(lin)酸(suan)脫(tuo)氫(qing)酶(mei)，在(zai)感染(ran)后(hou)顯著上調(diao)。與(yu)ATP生(sheng)(sheng)(sheng)成相關的(de)基(ji)因(yin)(yin)可(ke)(ke)能(neng)是由于寄生(sheng)(sheng)(sheng)后(hou)，為(wei)獲得(de)其發育和(he)繁殖(zhi)的(de)資(zi)源，T. chinensis 快速消耗ATP含(han)量所致。此外，谷(gu)氨酰胺合成酶(mei)（ GS）基(ji)因(yin)(yin)在(zai)感染(ran)后(hou)下調(diao)并(bing)且谷(gu)氨酸(suan)脫(tuo)氫(qing)酶(mei)（GDH）基(ji)因(yin)(yin)在(zai)中(zhong)華小長(chang)臂(bei)蝦中(zhong)上調(diao)。 GS和(he)GDH是在(zai)氮代(dai)(dai)謝中(zhong)起重要作用(yong)的(de)酶(mei)。對(dui)這些數據(ju)的(de)一(yi)種可(ke)(ke)能(neng)的(de)解釋是，寄生(sheng)(sheng)(sheng)蟲可(ke)(ke)能(neng)降低(di)代(dai)(dai)謝率或利用(yong)其宿(su)(su)主(zhu)的(de)氨和(he)氮的(de)代(dai)(dai)謝機制，隨后(hou)，利用(yong)更多的(de)ATP進(jin)行其發育和(he)繁殖(zhi)，類(lei)似(si)于在(zai)蛤蜊-蟲黃藻共生(sheng)(sheng)(sheng)系統中(zhong)觀(guan)察到的(de)。這些數據(ju)表明，等(deng)足類(lei)寄生(sheng)(sheng)(sheng)蟲可(ke)(ke)能(neng)通過激活宿(su)(su)主(zhu)能(neng)量或氮代(dai)(dai)謝而使其具(ju)有較低(di)的(de)宿(su)(su)主(zhu)運動(dong)行為(wei)。因(yin)(yin)此建議未來的(de)研究可(ke)(ke)以探討等(deng)足類(lei)寄生(sheng)(sheng)(sheng)蟲宿(su)(su)主(zhu)神(shen)經和(he)行為(wei)調(diao)節的(de)確切機制。
3.3 性(xing)腺(xian)發育功(gong)能相(xiang)關差異基因
等足類寄(ji)生(sheng)(sheng)(sheng)蟲(chong)會損(sun)害甲(jia)殼類動物(wu)宿主(zhu)的(de)(de)穩定性，嚴(yan)重妨礙(ai)其繁殖，例(li)如，寄(ji)生(sheng)(sheng)(sheng)蟲(chong)的(de)(de)營養剝奪實(shi)際上可(ke)以閹割(ge)甲(jia)殼類動物(wu)宿主(zhu)。盡管(guan)在本(ben)研(yan)究中未發(fa)現與(yu)營養代謝(xie)相(xiang)關(guan)的(de)(de)DEG，但寄(ji)生(sheng)(sheng)(sheng)蟲(chong)作用下(xia)調了必需的(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)殖相(xiang)關(guan)基因，特別是那(nei)些參與(yu)黃體酮介導的(de)(de)卵母(mu)細胞成熟途徑的(de)(de)基因，并下(xia)調了14個與(yu)生(sheng)(sheng)(sheng)殖相(xiang)關(guan)的(de)(de)DEGs。長度為672-5761bp（表4）。研(yan)究結(jie)果表明等足類寄(ji)生(sheng)(sheng)(sheng)蟲(chong)主(zhu)要通過直接(jie)激素變化影響宿主(zhu)，而不(bu)是通過營養缺乏的(de)(de)間接(jie)變化。
3.4 RT-qPCR驗證RNA-seq結(jie)果
6個(ge)DEG進行RT-qPCR來驗證(zheng)RNA-Seq分析結果。所有測試的(de)(de)基因在(zai)對照組和感染(ran)組之間顯(xian)示(shi)出顯(xian)著(zhu)的(de)(de)差(cha)異表達（圖6）。基因VO2，VOR，OZFPL和VASA在(zai)感染(ran)組中顯(xian)示(shi)低豐度(du)，而GA和GDH在(zai)感染(ran)后顯(xian)示(shi)出上調。結果表明RNA-Seq數(shu)據(ju)是可靠(kao)的(de)(de)。
Figure 6. qRT-PCR verification of differentially expressed unigenes
4. 結論
本研(yan)(yan)究(jiu)是T. chinensis和P. sinensis之間的(de)(de)(de)寄生(sheng)蟲 - 宿主相(xiang)互作(zuo)用的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)。 鑒定的(de)(de)(de)DEG顯(xian)示寄生(sheng)蟲主要影響宿主的(de)(de)(de)能(neng)量代謝(xie)，氮代謝(xie)和性腺發育。 雖然需(xu)要進一步研(yan)(yan)究(jiu)來驗證(zheng)研(yan)(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)結論，但目(mu)前的(de)(de)(de)結果表明，T. chinensis可能(neng)參(can)與轉(zhuan)運細胞內寄生(sheng)物，改變中(zhong)華小長(chang)臂蝦(xia)的(de)(de)(de)核(he)苷酸(suan)代謝(xie)物水平。 T. chinensis寄生(sheng)蟲下調與性腺發育相(xiang)關(guan)的(de)(de)(de)基因(yin)而不(bu)是與營(ying)養代謝(xie)相(xiang)關(guan)的(de)(de)(de)基因(yin)的(de)(de)(de)事(shi)實也表明了連鎖效(xiao)應。 總的(de)(de)(de)來說，該(gai)研(yan)(yan)究(jiu)提(ti)供了有(you)價值的(de)(de)(de)經驗數據，將支持甲殼類(lei)動物等(deng)足類(lei)寄生(sheng)蟲的(de)(de)(de)未來分子研(yan)(yan)究(jiu)。
原文索(suo)引(yin)：
Li Y, Xu W, Li X, et al. Comparative transcriptome analysis of Chinese grass shrimp ( Palaemonetes sinensis ) infected with isopod parasite Tachaea chinensis[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2018.
文章(zhang)鏈接：
//www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1050464818304856
