2018-01-09
溫熱的(de)南(nan)方，偶爾可見到(dao)一種“發型(xing)”很酷的(de)卷羽雞(ji)(ji)，羽毛蓬松翻卷，特(te)性獨立，在觀賞雞(ji)(ji)育種中頗受青(qing)睞；卷曲(qu)的(de)羽毛還能促進家雞(ji)(ji)散熱，從而“淡定”應對(dui)高溫，這對(dui)改善(shan)熱帶高溫地區(qu)家雞(ji)(ji)的(de)生(sheng)產性能也有(you)重(zhong)要的(de)經濟價值。
上海(hai)交通大(da)學孟(meng)和(he)教(jiao)授課(ke)題組(zu)和(he)廣東(dong)海(hai)洋大(da)學杜炳(bing)旺教(jiao)授研究(jiu)(jiu)團(tuan)隊開展合作，采(cai)用群體(ti)基因(yin)組(zu)學策略，探究(jiu)(jiu)中國麒(qi)麟雞卷(juan)羽特征的遺傳機制。
材 料
（1）GWAS研究(jiu)材料(liao)：選(xuan)取麒麟雞(ji)（卷羽）和(he)懷鄉雞(ji)（正(zheng)常）正(zheng)反交構建(jian)F1、F2家系(xi)。選(xuan)取F1代（18）、F2代（57）
（2）RNA-seq研究材(cai)料：3只(zhi)麒麟雞(ji)（KRC）、3只(zhi)懷(huai)鄉雞(ji)（HX）的卵泡組織(zhi)（發(fa)育(yu)13天的胚胎(tai)）
方 法(fa)
(1) 參考(kao)基因(yin)組：Gallus gallus (galGal5)
(2) 研究(jiu)策略(ddGBS)：測序(xu)平臺(Illumina HiSeq 2000)；平均測序(xu)深度：3 ×；
簡化測(ce)序(xu)酶切組合：Pst I 和 Msp I。
(3) 軟件：基(ji)(ji)因分(fen)型(BWA，GATK)；全(quan)基(ji)(ji)因組(zu)關(guan)聯分(fen)析(xi)(PLINK)； RNA-seq分(fen)析(xi)(TopHat 2； DESeq R package)。
KRC（麒(qi)麟雞）與HX（懷鄉雞）雜(za)交種群的(de)鑒定
KRC與HX的(de)正(zheng)反交(jiao)實驗表明，KRC的(de)卷(juan)羽特征(zheng)（圖1）是(shi)由常(chang)染色體基(ji)因控制的(de)不完(wan)全顯性遺傳(chuan)，符合孟德爾遺傳(chuan)定律。
圖1：卷羽與正(zheng)常(chang)雞的表型比較(jiao)
成年的(de)麒(qi)麟雞(ji)（a、b）與(yu)正常的(de)雞(ji)（c、d）相比，羽毛卷曲性狀明顯；出生1天的(de)麒(qi)麟雞(ji)（e）就表現出卷羽特征。
全基因組關聯分析(GWAS)
通過對F1（18只(zhi)）和F2（28只(zhi)純(chun)合卷羽(yu)雞(ji)、29只(zhi)羽(yu)毛正常(chang)雞(ji)）共75只(zhi)雞(ji)進行簡化(hua)基因(yin)組測序，獲(huo)得(de)1464 million條reads，數據過濾后，與參考基因(yin)組比對，獲(huo)得(de)的1,948,658個(ge)SNPs，進行全基因(yin)組關(guan)聯(lian)分析(xi)，進而定位與麒麟雞(ji)卷羽(yu)性狀相關(guan)的位點。
關(guan)聯分析(xi)結果顯示：共(gong)計獲得32個(ge)與(yu)麒麟雞卷羽特(te)征相關(guan)聯的(de)(de)SNPs位(wei)點(圖2)。大(da)多數主(zhu)效的(de)(de)SNP位(wei)點位(wei)于KRT75L4 基因(yin)第5個(ge)外(wai)顯子附近(jin)的(de)(de)130Kb的(de)(de)范(fan)圍，其他的(de)(de)SNP位(wei)點位(wei)于F基因(yin)（KRT75L2、KRT5、KRT7 和(he)KRT6A）的(de)(de)33號染(ran)色體附近(jin)1.19-1.52Mb范(fan)圍內(nei)，位(wei)于33號染(ran)色體的(de)(de)候選的(de)(de)QTL位(wei)點與(yu)α-角蛋白基因(yin)家族(zu)重疊。
圖2：麒麟雞和(he)懷鄉雞GWAS關聯(lian)分析曼哈頓(dun)圖
圖a曼哈頓(dun)(dun)圖顯示所有SNP與卷曲羽毛表型(xing)的聯系。不同(tong)顏色(se)(se)代表不同(tong)染色(se)(se)體，紅色(se)(se)線(xian)為閾值線(xian)。圖b為33號染色(se)(se)體的曼哈頓(dun)(dun)圖。
麒麟(lin)雞變異基因KRT75L4 的(de)鑒定
前人報(bao)道的控制卷羽矮雞(ji)的KRT75、KRT6A 基(ji)因(yin)并不是控制麒麟雞(ji)卷羽的基(ji)因(yin)，通過對候選基(ji)因(yin)（KRT5、KRT6A、KRT75、KRT75L2 和(he)KRT75L4）進行PCR擴增，結合sanger測(ce)序，發(fa)現KRT75L4 基(ji)因(yin)有15bp的缺失(shi)（圖3），改變了編碼蛋(dan)白的序列，造成麒麟雞(ji)卷羽的特征(zheng)。
圖(tu)3：KRT75L4基因的15 bp缺失及(ji)其側(ce)翼序(xu)列(lie)的熒光(guang)信號(hao)峰。
1,294,968的(de)序列(lie)是參考基(ji)因(yin)組（Gallus_gallus-5.0）的(de)33號染色體起(qi)始位點(dian)；參考基(ji)因(yin)組上、下序列(lie)分別(bie)來自HX和KRC個體，KRC缺失15bp；藍色、紅色背景分別(bie)為缺失的(de)上下游序列(lie)。
RNA-seq分析麒麟雞(ji)卷羽和正常懷鄉雞(ji)的(de)基(ji)因差異性(xing)表(biao)達
對(dui)3只麒麟雞（KRC）和3只懷鄉(xiang)雞（HX）的(de)(de)卵泡組織(zhi)進(jin)行RNA-seq，每個(ge)樣品獲得>37.4 million 的(de)(de)reads，分析結果顯(xian)示，KRC和HX比較，共計(ji)有(you)94個(ge)差異(yi)表達的(de)(de)基因(yin)(DEGs) ( |log2(K/H)| > 1; adjusted P-value < 0.05)。KRC與HX相比，50個(ge)基因(yin)上調，44個(ge)基因(yin)下調，進(jin)一步(bu)對(dui)差異(yi)表達基因(yin)進(jin)行功能(neng)分析，差異(yi)表達基因(yin)不(bu)在GWAS定(ding)位(wei)的(de)(de)33號染色體目標(biao)區段上，也不(bu)屬于(yu)α-keratin基因(yin)家族。
麒麟雞(ji)的(de)(de)(de)KRT75L4 基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)表(biao)達水平與懷鄉(xiang)雞(ji)一致，由于(yu)F型缺失，其轉(zhuan)錄(lu)產(chan)物較懷鄉(xiang)雞(ji)短（圖4），導致了Val-Leu-Pro-Ala-Ser轉(zhuan)錄(lu)產(chan)物的(de)(de)(de)缺失，影響了編碼蛋白的(de)(de)(de)表(biao)達。33號染(ran)色體的(de)(de)(de)其他(ta)α-角(jiao)蛋白家族的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)本在KRC和HX中是(shi)一致的(de)(de)(de)，因(yin)此KRT75L4 基(ji)因(yin)可(ke)能是(shi)控制(zhi)家雞(ji)卷(juan)羽(yu)性狀的(de)(de)(de)F基(ji)因(yin)。
圖4：KRC和HXC品種的KRT75L4 轉(zhuan)錄本可視化
HX group和KRC group的(de)(de)覆蓋區域(yu)(yu)分(fen)別為橙色(se)和綠色(se)，在KRC group的(de)(de)三個(ge)樣本中(zhong)觀察到中(zhong)前區域(yu)(yu)的(de)(de)缺(que)失的(de)(de)覆蓋度，這是由于F型缺(que)失導致的(de)(de)。
小 結
研究人(ren)員采用群體(ti)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組學(xue)策略(lve)對(dui)麒麟雞(ji)群體(ti)中(zhong)(zhong)受到選(xuan)擇作用的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)進(jin)行檢測，并(bing)在(zai)(zai)其他家(jia)雞(ji)群體(ti)中(zhong)(zhong)進(jin)行了驗證，最終(zhong)將候選(xuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)鎖定(ding)在(zai)(zai)第33號染色體(ti)的(de)KRT75L4 基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)。該基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)和之前報(bao)道的(de)KRT6A 基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)同屬α-角蛋白(bai)（α-keratin）基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)家(jia)族(zu)，該基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)家(jia)族(zu)在(zai)(zai)毛發(fa)生長中(zhong)(zhong)發(fa)揮著(zhu)重要(yao)的(de)作用。
此外，該(gai)工作表明群體基(ji)因組學(xue)分(fen)析可以(yi)應用于(yu)孟德爾性狀(zhuang)（Mendelian trait）定位研究，相比于(yu)基(ji)于(yu)構建(jian)雜(za)交(jiao)譜系進行(xing)連鎖分(fen)析的傳(chuan)統策略，群體基(ji)因組學(xue)分(fen)析顯得更加簡(jian)便易(yi)行(xing)。
參考文獻
Dong J, He C, Wang Z, et al., A novel deletion in KRT75L4 mediates the frizzle trait in a Chinese indigenous chicken. Genet Sel Evol. 2018, 50(1):68. (doi: 10.1186/s12711-018-0441-7)
