2018-03-22
最近，派森諾生物(wu)與上海第六人民醫院合作，在知名期(qi)刊(kan)《BMC Biology》（影(ying)響因子6.779）上發表(biao)研究(jiu)成果(guo)，通過飲食誘導(dao)的(de)肥(fei)胖小鼠模型(xing)，結合代謝組學(xue)和(he)微生物(wu)組學(xue)分(fen)析，揭示了(le)膽汁酸對腸道菌群的(de)重要塑造作用。
研究背景
眾(zhong)所(suo)周知(zhi)，腸(chang)(chang)道(dao)菌群(qun)(qun)通過(guo)腸(chang)(chang)道(dao)BAs（bile acid）生物轉化以(yi)及利用腸(chang)(chang)道(dao)核法(fa)尼醇X受(shou)體(ti)（FXR）刺激纖(xian)維原(yuan)細胞生長因子19的表(biao)達，來調控體(ti)內膽(dan)汁酸(suan)的平衡。另一方面，BAs因其強(qiang)大(da)的抗(kang)菌活性，可以(yi)直接調節腸(chang)(chang)道(dao)菌群(qun)(qun)。但是，哺乳(ru)動物的BAs和腸(chang)(chang)道(dao)菌群(qun)(qun)如何關(guan)聯，以(yi)及如何通過(guo)動態互作影(ying)響菌群(qun)(qun)組成，目前(qian)尚(shang)不清楚。
本研(yan)究系統評估了雄性C57BL/6小鼠(shu)在飲(yin)食誘導的(de)(de)(de)(de)肥胖模型中的(de)(de)(de)(de)BA變(bian)(bian)化(hua)(hua)和腸(chang)道(dao)菌(jun)群(qun)(qun)的(de)(de)(de)(de)改變(bian)(bian)。代謝組學分(fen)析了宿主——菌(jun)群(qun)(qun)共代謝物質(zhi)，說明BAs是一(yi)個影響腸(chang)道(dao)菌(jun)群(qun)(qun)的(de)(de)(de)(de)變(bian)(bian)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)重要因素。小鼠(shu)喂(wei)食HFD（high-fat diet）或者BAs后，分(fen)析BA的(de)(de)(de)(de)變(bian)(bian)化(hua)(hua)和菌(jun)群(qun)(qun)組成變(bian)(bian)化(hua)(hua)以及腸(chang)道(dao)菌(jun)群(qun)(qun)對(dui)HFD的(de)(de)(de)(de)動態響應，檢(jian)測BAs和腸(chang)道(dao)菌(jun)群(qun)(qun)組成變(bian)(bian)化(hua)(hua)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)關(guan)聯，從而(er)提出一(yi)種新的(de)(de)(de)(de)治(zhi)療方案，即通過靶向BA代謝阻止和治(zhi)療代謝疾病。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq平臺
測序模式：16S rRNA基因V4-V5區
實驗設計：
研究結果
3.1 HFD治療引起的代謝組和腸道菌群變化的相關性揭示BAs是影響腸道菌群的重要因素
代謝(xie)組(zu)測定(ding)（GC/TOFMS、UPLC/TQMS、UPLC/QTOFMS等）和(he)16S rRNA測序結果分析表明BAs與8個門(men)水平上的(de)(de)(de)腸(chang)道(dao)菌(jun)群(qun)中的(de)(de)(de)5個是顯(xian)著(zhu)相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)，說明BAs是影響(xiang)腸(chang)道(dao)菌(jun)群(qun)的(de)(de)(de)相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)代謝(xie)物。對Control組(zu)和(he)HFD組(zu)的(de)(de)(de)小鼠進行BAs含量的(de)(de)(de)定(ding)量分析，發現HFD組(zu)盲腸(chang)中BAs水平顯(xian)著(zhu)增加。所有CA衍生得到(dao)的(de)(de)(de)BAs的(de)(de)(de)水平顯(xian)著(zhu)增加了(le)，說明這些BAs可能是對高(gao)脂飲食產生響(xiang)應(ying)的(de)(de)(de)重要BA類別。
圖1 代謝物與門水平腸道菌群的相關性以及隨著HFD的干預引起的BA變化
3.2 高脂飲食引起的腸道菌群的改變及其與BAs的關聯
Simpson指數(shu)在HFD組中要(yao)比Control組要(yao)低，說明(ming)菌(jun)(jun)群(qun)的(de)(de)多樣性在HFD干預后降低。PCoA和(he)(he)基于Bray–Curtis的(de)(de)聚類分(fen)(fen)析(xi)結(jie)果(guo)表明(ming)兩組之間能明(ming)顯(xian)分(fen)(fen)離。菌(jun)(jun)群(qun)豐(feng)度(du)分(fen)(fen)析(xi)發(fa)現在Control組中主要(yao)是(shi)(shi)Proteobacteria (41.91%)，Firmicutes (30.59%)，和(he)(he)Bacteroidetes (26.22%)，但是(shi)(shi)在HFD組中主要(yao)是(shi)(shi)Firmicutes (47.51%)，Proteobacteria (34.86%) 和(he)(he) Bacteroidetes(16.94%)。熱圖結(jie)果(guo)表明(ming)42種BAs中有33個(ge)至少和(he)(he)一種菌(jun)(jun)群(qun)顯(xian)著相(xiang)關(guan)。Bacteroidetes 和(he)(he)Verrucomicrobia中的(de)(de)大多數(shu)菌(jun)(jun)群(qun)和(he)(he)BA的(de)(de)變化是(shi)(shi)負相(xiang)關(guan)的(de)(de)，Firumicutes 和(he)(he)Proteobacteria中的(de)(de)菌(jun)(jun)群(qun)卻是(shi)(shi)正相(xiang)關(guan)的(de)(de)。
圖2 小鼠盲腸中HFD引起的菌群組成變化
3.3 BAs如何改變腸道菌群組成
對不同時(shi)(shi)(shi)間(jian)點(dian)的(de)(de)Control組(zu)和HFD組(zu)進行PLS-DA分析，表明(ming)(ming)在HFD干(gan)(gan)預的(de)(de)第一天顯著改(gai)變(bian)，菌群(qun)在D1到(dao)(dao)(dao)D3發生(sheng)大幅(fu)度上下波動。BAs的(de)(de)數(shu)量(liang)(liang)在HFD干(gan)(gan)預12h后就達(da)到(dao)(dao)(dao)了穩定期，表明(ming)(ming)HFD快速刺激(ji)了BA分泌。菌群(qun)數(shu)量(liang)(liang)逐(zhu)步增(zeng)(zeng)加，在D3達(da)到(dao)(dao)(dao)了高值。HFD干(gan)(gan)預后10天，所有檢測到(dao)(dao)(dao)的(de)(de)BAs都(dou)有上下波動，同時(shi)(shi)(shi)兩種菌群(qun)在D28時(shi)(shi)(shi)被影(ying)響。這(zhe)說明(ming)(ming)HFD的(de)(de)干(gan)(gan)預先對BAs產生(sheng)響應，可能(neng)再(zai)同時(shi)(shi)(shi)影(ying)響腸(chang)道菌群(qun)。腸(chang)道菌群(qun)的(de)(de)改(gai)變(bian)遲于(yu)BA的(de)(de)增(zeng)(zeng)加，意味著BAs可能(neng)調控(kong)腸(chang)道菌群(qun)的(de)(de)組(zu)成。
圖3 BAs隨時間發生的變化及菌群對HFD的響應
3.4 BAs單獨誘導肥胖相關腸道菌群發生變化
CA型BAs在HFD干預后顯(xian)著增加，表(biao)明這些(xie)BAs的主要作用是(shi)和(he)高脂飲食(shi)有關聯。喂食(shi)GCA和(he)TCA顯(xian)著改(gai)變了總(zong)BA特別是(shi)次級(ji)BAs增加。補充BAs顯(xian)著改(gai)變了小鼠的表(biao)型和(he)生(sheng)化(hua)指標(biao)，變化(hua)趨(qu)勢和(he)HFD中類似。體重增長(chang)，脂肪(fang)量，肝(gan)臟重量和(he)血清總(zong)膽(dan)固醇都得到增加。結果證實表(biao)型改(gai)變和(he)BA的調(diao)控相(xiang)關。
16S rRNA基(ji)因測序(xu)結(jie)果表(biao)明，和(he)Control組(zu)相比，Alpha多樣性Simpson指(zhi)數(shu)在Control+BA組(zu)中(zhong)是(shi)(shi)減(jian)少的(de)(de)(de)(de)，比HFD組(zu)中(zhong)還要(yao)低。PCoA分析表(biao)明對標準飲(yin)食(shi)的(de)(de)(de)(de)菌(jun)群(qun)(qun)組(zu)成，BA和(he)HFD有(you)著類(lei)似(si)的(de)(de)(de)(de)改變效(xiao)果。和(he)Control組(zu)相比，Control+BA組(zu)中(zhong)腸道(dao)菌(jun)群(qun)(qun)主(zhu)要(yao)變化是(shi)(shi)Bacteroidetes (26.22% to 23.53%) 和(he)Firmicutes (30.59% to 33.24%)，但是(shi)(shi)Verrucomicrobia顯(xian)著減(jian)少。這和(he)HFD組(zu)結(jie)果類(lei)似(si)。熱圖(tu)結(jie)果顯(xian)示(shi)HFD組(zu)和(he)Control+BA組(zu)的(de)(de)(de)(de)菌(jun)群(qun)(qun)有(you)類(lei)似(si)的(de)(de)(de)(de)變化趨(qu)勢。這樣的(de)(de)(de)(de)結(jie)果意(yi)味肥胖相關的(de)(de)(de)(de)腸道(dao)菌(jun)群(qun)(qun)中(zhong)R. gnavus，Blautia spp.，Allobaculum spp.，Bilophila spp.，Desulfovibrio spp.，Prevotella spp.，Bacteroides spp.，和(he)Akkermansia muciniphila可能受BAs的(de)(de)(de)(de)調控。
圖4 喂食HFD和BA后BAs濃度，生理變化和菌群組成
3.5 減少BA可以作為一種衰減HFD誘導的腸道菌群變化和肥胖表型的備選治療方案
FXR興奮劑，GW4064可(ke)以(yi)抑制C57BL/6J小(xiao)鼠肝臟中BA的(de)合成。和(he)(he)預期的(de)結(jie)果(guo)一樣，GW4064的(de)使用(yong)減(jian)弱了HFD組小(xiao)鼠中BA的(de)增加，特別是總BAs和(he)(he)次級(ji)(ji)BAs。抗生(sheng)素(su)抑制了腸道菌群后，和(he)(he)HFD組相比BAs特別是初級(ji)(ji)BAs顯著增加了。喂食了摻雜有GW4064的(de)HFD組的(de)小(xiao)鼠，體(ti)(ti)重(zhong)(zhong)并沒有增加，同樣減(jian)少(shao)了脂肪量和(he)(he)肝臟重(zhong)(zhong)量。另外補充GW4064中和(he)(he)了HFD誘導血清(qing)總膽固醇升高(gao)的(de)作用(yong)。在(zai)HFD+rifaximin組中，發現體(ti)(ti)重(zhong)(zhong)，腹部脂肪組織重(zhong)(zhong)量，肝臟重(zhong)(zhong)量和(he)(he)血清(qing)總膽固醇都有所減(jian)少(shao)。
通(tong)過(guo)GW4064誘導的BA調控(kong)作用，腸(chang)道(dao)(dao)菌(jun)群(qun)(qun)(qun)的Alpha多樣(yang)性顯著增加。PCoA分析(xi)表(biao)明(ming)HFD+GW4064組(zu)和Control組(zu)更相似，說(shuo)明(ming)肥(fei)胖(pang)(pang)相關的腸(chang)道(dao)(dao)菌(jun)群(qun)(qun)(qun)的組(zu)成(cheng)經過(guo)BA調控(kong)作用后會(hui)得到反轉(zhuan)。門水平柱狀圖表(biao)明(ming)HFD+ GW4064組(zu)的腸(chang)道(dao)(dao)菌(jun)群(qun)(qun)(qun)的組(zu)成(cheng)和Control組(zu)很類似。所以，利用FXR抗生素可以阻(zu)止(zhi)或者反轉(zhuan)高(gao)脂(zhi)飲食誘導的腸(chang)道(dao)(dao)菌(jun)群(qun)(qun)(qun)的變化，改(gai)善(shan)肥(fei)胖(pang)(pang)表(biao)型(xing)的發展。
圖5 喂食HFD, HFD + GW4064, and HFD + rifaximin之后BAs的濃度，生理變化及菌群的組成
總 結
通過(guo)定(ding)量測(ce)定(ding)小鼠中小分子(zi)代謝(xie)物，發現內生代謝(xie)物中BAs是和菌(jun)群(qun)變化相關(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)重要的(de)(de)(de)(de)(de)因子(zi)。高脂飲(yin)(yin)食(shi)(shi)（HFD）的(de)(de)(de)(de)(de)干(gan)預(yu)，導(dao)致12h內BA快(kuai)速(su)且(qie)顯著的(de)(de)(de)(de)(de)增加，隨后在(zai)24h內改變了菌(jun)群(qun)組成，證(zheng)(zheng)明(ming)BAs是調(diao)控腸道(dao)菌(jun)群(qun)的(de)(de)(de)(de)(de)主要飲(yin)(yin)食(shi)(shi)因素。研(yan)究結果(guo)表明(ming)BAs和HFD誘導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)腸道(dao)菌(jun)群(qun)的(de)(de)(de)(de)(de)變化之(zhi)間有相互關(guan)聯的(de)(de)(de)(de)(de)關(guan)系。通過(guo)BA分泌(mi)或者合成的(de)(de)(de)(de)(de)減少，證(zheng)(zheng)實膳食(shi)(shi)干(gan)預(yu)和FXR活化在(zai)肥胖治療中起著關(guan)鍵(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)控作(zuo)用。
參考文獻
Zheng X, Huang F, Zhao A, et al. Bile acid is a significant host factor shaping the gut microbiome of diet-induced obese mice[J]. BMC Biology, 2017, 15(1):120.
