2018-04-26
派森諾生物與中科院水(shui)生生物研究所攜手合作(zuo)，通(tong)過 Illumina NextSeq500高通(tong)量(liang)測(ce)(ce)序平(ping)臺，應用轉(zhuan)(zhuan)錄組測(ce)(ce)序方法，對草(cao)魚呼腸孤(gu)病毒進行了基因轉(zhuan)(zhuan)錄水(shui)平(ping)的(de)研究，對GCRV感染的(de)草(cao)魚腎（CIK）細(xi)胞轉(zhuan)(zhuan)錄水(shui)平(ping)的(de)變化進行了分析，揭(jie)示了GCRV感染的(de)機制(zhi)。作(zuo)者陳庚(geng)和通(tong)訊作(zuo)者汪(wang)亞平(ping)關于(yu)GCRV轉(zhuan)(zhuan)錄組測(ce)(ce)序的(de)研究成果《Transcriptomics Sequencing Provides Insights into Understanding the Mechanism of Grass Carp Reovirus Infection》于(yu)2018年2月6日(ri)發表在《International Journal of Molecular Sciences》上。
草魚（Ctenopharyngodon idellus）是中(zhong)(zhong)國(guo)重要(yao)的水產養殖魚類(lei)，2015年草魚產量達到(dao)580萬噸，占(zhan)世界(jie)淡水養殖產量的13％以(yi)上。草魚呼腸孤(gu)病(bing)(bing)毒（GCRV）可(ke)以(yi)引起草魚的出(chu)血(xue)性疾病(bing)(bing)，該疾病(bing)(bing)是對(dui)草魚具破(po)壞性的疾病(bing)(bing)之一(yi)，會(hui)造成草魚養殖業巨大(da)的經濟(ji)損失。近來(lai)，對(dui)GCRV的研究主(zhu)要(yao)集(ji)中(zhong)(zhong)在鑒定(ding)參與(yu)GCRV感染免(mian)疫應答的基因，GCRV編碼蛋白的克隆和鑒定(ding)，GCRV疫苗的開(kai)發(fa)等(deng)方面，對(dui)于GCRV侵(qin)襲和感染的機制仍有待(dai)闡(chan)明。
GCRV感染(ran)誘導細胞病(bing)變效應
模擬(ni)感染(ran)和病毒感染(ran)的細胞變化圖
在(zai)模擬感(gan)染的(de)細(xi)胞(bao)中(zhong)未觀察到(dao)(dao)細(xi)胞(bao)病變效應（CPE）。然(ran)而，在(zai)感(gan)染GCRV的(de)細(xi)胞(bao)中(zhong)，感(gan)染后8小時(shi)觀察到(dao)(dao)CPE，并隨著時(shi)間的(de)推移變得(de)更明顯。感(gan)染后72小時(shi)，可以看到(dao)(dao)大(da)部分(fen)細(xi)胞(bao)壞死.
CCK-8 kit細(xi)胞活力試驗
細(xi)胞活力試(shi)驗(yan)結果圖
模擬(ni)感染細(xi)胞顯示接近100％的生存(cun)力，而感染8, 24和72小時(shi)的細(xi)胞，僅觀察到(dao)74.66％，56.88％和36.95％的細(xi)胞活力。因(yin)此，結果提示GCRV的感染是有(you)效的。
轉錄(lu)組序(xu)列數據初步分析
PCA分析結果(guo)
對測序(xu)數據(ju)(ju)的(de)(de)(de)整理可以看出，對于(yu)(yu)所有文庫，Q20≥96％，Q30≥92％，比(bi)對百分(fen)(fen)比(bi)≥87％。這些結(jie)果(guo)表(biao)明了(le)測序(xu)數據(ju)(ju)的(de)(de)(de)高質量。根(gen)據(ju)(ju)表(biao)達水平(ping)對每個(ge)樣(yang)品進(jin)行的(de)(de)(de)主成分(fen)(fen)分(fen)(fen)析（PCA）結(jie)果(guo)表(biao)明模擬(ni)感染(ran)細胞明顯(xian)不同于(yu)(yu)感染(ran)GCRV的(de)(de)(de)細胞。此(ci)外(wai)，對于(yu)(yu)感染(ran)GCRV的(de)(de)(de)樣(yang)品的(de)(de)(de)相(xiang)關值與(yu)感染(ran)后時間成正(zheng)比(bi); 8小(xiao)時的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)與(yu)24小(xiao)時和72小(xiao)時的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)不一(yi)致。
表達差(cha)異基因（DEG）鑒(jian)定
將GCRV感染過(guo)程(cheng)分(fen)為三個階段：早期(qi)（感染后(hou)0-8小時），中間（感染后(hou)8-24小時）和晚期(qi)（24-72小時）階段。在每個階段，將來自后(hou)一時間點(dian)的數據(ju)與前者進行比(bi)較（8與0, 24與8和72與24對比(bi)）以鑒定(ding)差(cha)異表(biao)達的基因（DEG）。
GO和KEGG富集分(fen)析
上表中列出了感染后(hou)三個階段(duan)中富集(ji)(ji)的(de)前五個GO Term信息。GO富集(ji)(ji)分析結(jie)果表明，感染的(de)早(zao)期(qi)階段(duan)主(zhu)要(yao)與鐵(tie)運輸，碳水(shui)化合(he)物(wu)代謝和包涵體有(you)(you)關(guan)。在感染的(de)中期(qi)，鐵(tie)離子結(jie)合(he)，溶酶體類顯著富集(ji)(ji)。同(tong)時，后(hou)期(qi)階段(duan)主(zhu)要(yao)與代謝過程有(you)(you)關(guan)，如脂(zhi)質生物(wu)合(he)成，類固醇(chun)代謝和酒精生物(wu)合(he)成代謝。
上表(biao)展(zhan)示了(le)三(san)個階(jie)段中富集的前五個KEGG pathway信(xin)息。KEGG富集分析的結(jie)果則表(biao)明，在(zai)(zai)感(gan)染早期(qi)，DEGs主(zhu)要(yao)涉及與局灶粘附(fu)，ECM（細胞(bao)(bao)外基質）-受(shou)體相互作用，細胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)-細胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)受(shou)體相互作用有關的途徑。在(zai)(zai)中期(qi)，與病毒進(jin)入(ru)細胞(bao)(bao)和細胞(bao)(bao)識別(bie)有關的途徑被富集，包括吞噬體，溶(rong)酶體和hippo信(xin)號通路(lu)。在(zai)(zai)感(gan)染后期(qi)，顯著富集的途徑是類固醇和類萜骨架(jia)的生(sheng)物合(he)成，以(yi)及酮(tong)體的降解。
在(zai)關鍵KEGG pathway中表達的DEG
; 選(xuan)定的KEGG通(tong)路中DEGs的表達模式線圖
進一(yi)步評估ECM-受(shou)體(ti)(ti)相(xiang)互作用，局灶粘附，吞噬(shi)體(ti)(ti)和溶酶相(xiang)關的(de)(de)關鍵(jian)KEGG pathway中(zhong)DEGs的(de)(de)表達(da)模式，對感染(ran)后每個時間點四種KEGG途徑進行比(bi)較，結果顯示(shi)，這些DEGs的(de)(de)表達(da)模式存在(zai)顯著(zhu)差異。具體(ti)(ti)來(lai)看，與ECM-受(shou)體(ti)(ti)相(xiang)互作用和局灶粘附相(xiang)關的(de)(de)DEGs，如(ru)col5a1，itgb7和sptbn5在(zai)感染(ran)早期(qi)階段上調(diao)(diao)，但(dan)在(zai)中(zhong)期(qi)和晚期(qi)階段下(xia)調(diao)(diao)。相(xiang)反(fan)，參(can)與吞噬(shi)體(ti)(ti)和溶酶體(ti)(ti)的(de)(de)DEGs的(de)(de)表達(da)，如(ru)itgb2，srb1，和sel1呈(cheng)現相(xiang)反(fan)的(de)(de)趨勢，在(zai)感染(ran)早期(qi)下(xia)調(diao)(diao)，但(dan)在(zai)中(zhong)后期(qi)上調(diao)(diao)。
三個感染階段關鍵DEG的(de)鑒定
關(guan)鍵的(de)(de)DEGs可能(neng)在(zai)對環境變化的(de)(de)應對中發揮重要作用，因(yin)此(ci)會對它們進行(xing)識別和(he)(he)(he)注釋。分(fen)析的(de)(de)結果(guo)顯示(shi)，感染后(hou)(hou)0至8h之(zhi)間的(de)(de)大多數上(shang)調(diao)(diao)(diao)(diao)基(ji)(ji)因(yin)（例如(ru)ptpε，itga7和(he)(he)(he)ppl）與細(xi)胞(bao)(bao)信號傳導相(xiang)關(guan)，而諸如(ru)cxcl10和(he)(he)(he)ifi271的(de)(de)下調(diao)(diao)(diao)(diao)基(ji)(ji)因(yin)則與免疫(yi)相(xiang)關(guan)。8至24 h間上(shang)調(diao)(diao)(diao)(diao)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)包括viperin，tap1，tlr3和(he)(he)(he)irf11。同時，下調(diao)(diao)(diao)(diao)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)如(ru)angptl2，pgp和(he)(he)(he)rap1gap1，主(zhu)要與血管有關(guan)，這(zhe)也可能(neng)解釋了為什么(me)草(cao)魚在(zai)GCRV感染后(hou)(hou)會出現出血癥狀。其(qi)他下調(diao)(diao)(diao)(diao)基(ji)(ji)因(yin)包括蛋白質損(sun)傷修復相(xiang)關(guan)基(ji)(ji)因(yin)，如(ru)mical3b和(he)(he)(he)hspb11。最后(hou)(hou)，在(zai)24和(he)(he)(he)72h之(zhi)間，上(shang)調(diao)(diao)(diao)(diao)基(ji)(ji)因(yin)主(zhu)要與程序性細(xi)胞(bao)(bao)死亡(wang)，細(xi)胞(bao)(bao)凋亡(wang)和(he)(he)(he)炎癥相(xiang)關(guan)，與在(zai)24和(he)(he)(he)72h觀察(cha)到(dao)的(de)(de)較高(gao)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)活力降低結果(guo)一致。 此(ci)階段的(de)(de)下調(diao)(diao)(diao)(diao)基(ji)(ji)因(yin)主(zhu)要參與類固醇合成，而另一些則與微管和(he)(he)(he)血管有關(guan)。
關鍵(jian)干擾素(su)相關基(ji)因(yin)的表達模式
涉及免疫(yi)應答(da)的關(guan)鍵基(ji)因的表達模式
本研(yan)究檢測了關鍵(jian)的干擾素相關基(ji)因的表(biao)達模式。結果(guo)表(biao)明(ming)，除(chu)基(ji)因mx-1外，大(da)多數基(ji)因在感染后24或(huo)72h顯示為log2倍數變化≥2甚至≥10，而在感染后8h表(biao)達水平(ping)下(xia)降。這些結果(guo)說明(ming)了GCRV感染誘導的強免疫應答。
選定的DEG的 RT-qPCR驗證
RT-qPCR驗證轉錄組測序數(shu)據(ju)
為(wei)了(le)證實RNA-Seq數據的可靠(kao)性，選擇(ze)了(le)參與(yu)吞噬體途徑的8個基因(yin)(yin)進行RT-qPCR分析(xi)。驗證的結果(guo)表(biao)明，通(tong)過(guo)qPCR獲(huo)得的所有8個DEG的表(biao)達模式與(yu)來自RNA-Seq分析(xi)的表(biao)達模式相似，盡管相對(dui)表(biao)達水平不完全一(yi)致。 因(yin)(yin)此，RT-qPCR分析(xi)的結果(guo)證實了(le)RNA-Seq數據的可靠(kao)性和準(zhun)確性。
結論：
研究表明，在感染早期，GCRV與多糖相互作用并積聚在細胞表面，然后與GCRV受體結合啟動由整聯蛋白介導的內吞作用。在感染的中期，GCRV很可能受v-SNARE蛋白的調控并從內體區運輸至溶酶體。在階段，GCRV通過幾種不同途徑影響細胞膜中類固醇的結構，然后在階段導致細胞死亡。這些發現拓寬了現有的對GCRV入侵的認識，并可能對制定針對GCRV的疾病戰略有幫助。
原文索引：Chen G, He L, Luo L, et al. Transcriptomics Sequencing Provides Insights into Understanding the Mechanism of Grass Carp Reovirus Infection.[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(2):488.
