2023-08-15
《Science of the Total Environment》
影響因子：9.8
文章題目：Polystyrene nanospheres-induced hepatotoxicity in swamp eel (Monopterus albus): From biochemical, pathological and transcriptomic perspectives 技(ji)術手(shou)段：轉(zhuan)錄組 上海市農業科學院于近期在《Science of the Total Environment》上發表了聚苯乙烯納米球誘導的黃鱔肝毒性：來自生化、病理和轉錄組學的角度的研究成果。本研究的轉錄組測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
作為普遍存在的(de)(de)(de)新興污染物，水環(huan)境(jing)中(zhong)的(de)(de)(de)微塑料（MPs）已經引(yin)起(qi)了(le)(le)全球(qiu)的(de)(de)(de)廣泛(fan)關(guan)注。盡(jin)管(guan)我(wo)們先前(qian)的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究已經很好(hao)地描述(shu)了(le)(le)淡(dan)水農業生(sheng)態系統(tong)中(zhong)MPs的(de)(de)(de)存在和(he)特征(zheng)，但它們對黃鱔(shan)的(de)(de)(de)生(sheng)態毒(du)理(li)(li)學影響仍然是未(wei)知(zhi)的(de)(de)(de)。肝(gan)臟是動物體內最大的(de)(de)(de)器官，在脂質代謝和(he)外源(yuan)性解(jie)毒(du)中(zhong)起(qi)著關(guan)鍵作用。在魚類中(zhong)，它對外部環(huan)境(jing)刺激極為敏感，易受(shou)MPs暴(bao)(bao)露(lu)的(de)(de)(de)影響，因此適(shi)合于應(ying)激反應(ying)和(he)環(huan)境(jing)監測。本(ben)研(yan)(yan)究的(de)(de)(de)重(zhong)點(dian)是在黃鱔(shan)的(de)(de)(de)肝(gan)臟上，通過理(li)(li)化生(sheng)物標志物測量、組(zu)織(zhi)病理(li)(li)學分析和(he)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)，確定原始(shi)PS-NPs（100 nm）暴(bao)(bao)露(lu)的(de)(de)(de)毒(du)理(li)(li)學特征(zheng)和(he)機制。研(yan)(yan)究結果不(bu)僅揭示(shi)了(le)(le)PS-MPs誘導黃鱔(shan)肝(gan)毒(du)性的(de)(de)(de)毒(du)理(li)(li)學機制，還強調(diao)了(le)(le)養(yang)殖環(huan)境(jing)中(zhong)MPs污染的(de)(de)(de)生(sheng)態風險和(he)適(shi)當管(guan)理(li)(li)。
一、技術路線
二、研究結果
PS-NPs暴露引起的氧化應激反應 在(zai)不(bu)同濃(nong)度的PS-NPs暴(bao)露28天后，ROS、MDA、8-OHdG和(he)(he)MFO水(shui)平與對照相比顯(xian)(xian)著(zhu)上升，在(zai)10 mg/L時分別(bie)上升了74.4%、2.43倍、99.2%和(he)(he)24.0%。相反(fan)，隨著(zhu)濃(nong)度的升高，SP含量和(he)(he)T-AOC活(huo)性(xing)呈下(xia)降(jiang)趨勢，分別(bie)顯(xian)(xian)著(zhu)下(xia)降(jiang)44.5%和(he)(he)31.5%。而(er)TAOC和(he)(he)MFO在(zai)0.5 mg/L和(he)(he)5 mg/L濃(nong)度下(xia)的活(huo)性(xing)最(zui)高，分別(bie)顯(xian)(xian)著(zhu)提高42.4%和(he)(he)40.2%。 PS-NPs暴露對肝臟生理代謝的影響 暴露(lu)于PS-NPs后，肝臟生理(li)功能明顯受到影(ying)響，GPT（60.1%）、AKP（52.0%）、ACP（36.2%）和LDH（26.9%）的活性(xing)在(zai)(zai)10 mg/L時(shi)(shi)下降(jiang)幅度最大，GOT的活性(xing)在(zai)(zai)5 mg/L時(shi)(shi)下降(jiang)幅度最大（59.5%）但在(zai)(zai)10 mg/L時(shi)(shi)略有上升(sheng)。相反(fan)，TG、TC和HIS水平呈濃度依賴性(xing)增(zeng)加，分(fen)別上升(sheng)了54.2-244.4%、18.3-49.8%和22.3-30.5%。 圖1 PS納米微球對暴(bao)露28 d后肝臟生(sheng)理和脂質代謝的(de)影響 PS-NPs暴露對肝細胞凋亡及組織形態學的影響 在中(zhong)至(zhi)高濃度(du)PS-NPs處理(li)后，細胞凋亡標志物如Cytc、Caspase 3、8、9的活性均較對照(zhao)顯著(zhu)升高，分(fen)別(bie)上升55.9 - 77.6%、26.9 - 57.1%、45.7%和46.2 - 59.0%。TUNEL檢測表(biao)明，在PS-NPs暴露(lu)期(qi)間，凋亡陽性細胞以濃度(du)依賴性的方式(shi)增加，與對照(zhao)相比(bi)，10 mg/L組(zu)里綠(lv)色熒光(guang)強度(du)更強，凋亡率約為76.0倍，PCD為75.0倍。另一方面，DAPI標記的肝細胞核（藍色熒光(guang)）在處理(li)后表(biao)現(xian)出無序(xu)和縮少的模式(shi)。 如圖所示(shi)(shi)，對照組肝(gan)細(xi)胞排列均勻緊湊(cou)，細(xi)胞核大且呈球(qiu)形(xing)。而PS-NPs球(qiu)體可(ke)導致嚴重的肝(gan)臟損傷，表現為一系列形(xing)態(tai)畸形(xing)，如空泡變性（紅色(se)(se)五邊(bian)形(xing)）、炎癥浸潤（綠(lv)色(se)(se)箭(jian)(jian)頭）、充血（黃色(se)(se)箭(jian)(jian)頭）等。此外(wai)，隨著(zhu)暴(bao)露濃(nong)度的增加，更多的脂滴（黑色(se)(se)箭(jian)(jian)頭）沉積，ORO染色(se)(se)也顯示(shi)(shi)了這一點，肝(gan)組織中紅色(se)(se)脂滴數量的依次(ci)遞增。 圖2 PS-NPs對暴露28天后肝細胞凋亡的影響 圖3 PS-NPs暴露28天后肝臟組織病理學和脂質沉積的變化 PS-NPs處理后GO和KEGG富集分析 在(zai)C vs L中，前(qian)20個(ge)(ge)GO條目(mu)被(bei)分為(wei)兩個(ge)(ge)子(zi)集，即細(xi)胞成分（CC）和分子(zi)功能（MF），主要富(fu)集在(zai)膜和催(cui)化活(huo)性相關的(de)(de)條目(mu)。前(qian)20個(ge)(ge)KEGG通路被(bei)劃分為(wei)5個(ge)(ge)大類，大多數被(bei)富(fu)集的(de)(de)DEGs上(shang)調并歸屬于機體系統，即蛋(dan)白質消(xiao)(xiao)化吸(xi)收(shou)、脂(zhi)肪消(xiao)(xiao)化吸(xi)收(shou)、脂(zhi)肪細(xi)胞因(yin)子(zi)信號通路。值得注意的(de)(de)是，細(xi)胞凋(diao)亡(wang)、醚(mi)脂(zhi)代謝和甘(gan)油(you)脂(zhi)代謝也(ye)發(fa)生了顯著的(de)(de)改變。 就(jiu)C vs M而(er)言，前(qian)20個GO條目被(bei)分(fen)為生物過程(cheng)（BP）和(he)(he)MF，其中DEGs優先富(fu)集在單一生物過程(cheng)和(he)(he)對刺(ci)激的(de)反應。前(qian)20個KEGG通(tong)路被(bei)劃分(fen)為6個大類，大多數被(bei)定位(wei)的(de)DEGs下調并與人(ren)類疾病有關，即脂(zhi)質和(he)(he)動脈粥樣硬化、肝(gan)細胞癌。 關于C vs H，前(qian)20個GO條目被分為(wei)(wei)三(san)個亞(ya)組(zu)，即CC、BP和MF，主(zhu)要富集在(zai)細胞(bao)質和氧(yang)化還原過程相(xiang)關的條目。前(qian)20個KEGG通路(lu)被劃分為(wei)(wei)6個大類，大多數(shu)被定位的DEGs下(xia)調并與(yu)人類疾病有關，即化學致癌(ai)-活性氧(yang)、非(fei)酒精性脂肪性肝（NAFLD）、肝細胞(bao)癌(ai)。此外，氧(yang)化磷(lin)酸化也顯著富集。 圖4 GO和KEGG富集分析 PS-MPs對Keap1-Nrf2信號轉錄表達的影響 在正常條件下，Nrf2通過與keap1偶聯而保持異二聚體狀態。而ROS誘導的細胞應激導致Nrf2-keap1復合物的解離，磷酸化的Nrf2釋放并易位進入細胞核，在細胞核中Nrf2與sMaf二聚并結合到位于細胞保護基因啟動子區域的ARE上，最終激活下游的抗氧化和解毒基因。PS-NPs暴露后，10 mg/L組Nrf2顯著上調，而sMaf下調，導致除Gpx7、Cyp11A、Cyp24A1和Cyp2K1-like外，抗氧化防御酶和CYP450家族的表達主要受到抑制。相反，編碼Hsp超家族的基因隨暴露濃度的升高呈上升趨勢，且大部分在C vs H中受到顯著刺激。 PS-MPs對p53信號轉錄表達的影響 PS-NPs通過細胞膜進入細胞質并引起DNA損傷，8-OHdG水平顯著升高就是證據。隨后，p53被分別由ATR和ATM激活的Chk1和Chk2磷酸化。被激活的p53進一步觸發涉及死亡受體Fas和DR5的外源性凋亡通路。最后，Cytc激活伴隨著caspase-9、caspase-3的上調，導致細胞蛋白裂解和凋亡。另外，IGF-BP3被p53轉錄激活，并通過抑制IGF促進p53依賴性細胞凋亡。暴露濃度相對較高的組中，Cytcsb、Cytcb、Casp3、Casp9和IGF-BP3的轉錄物水平顯著上調。值得注意的是，在這三種類型中p53的表達均有相當大的升高，但并不顯著。 圖5 轉錄組學分析揭示的PS-NPs慢性暴露對p53信號通路的調控示意圖 PS-MPs對PPAR信號轉錄表達的影響 PPARs的三種亞類（α、β、γ）與RXR作為異二聚體伴侶偶聯，并與PPRE結合，控制脂質代謝、脂肪生成和代謝穩態相關基因的表達。隨著暴露濃度的升高，用于脂質轉移的FATP6和用于脂質攝取的FABP的轉錄水平分別被顯著抑制和刺激。PPARs和RXR復合物的抑制進一步導致下游效應基因的失調，即膽固醇代謝的LXRα顯著下調；KMGCS1用于酮生成；參與脂肪酸氧化的ACO、SCP2、LCADvl以及參與脂肪生成的SCDb上調；MMP、Angptl3、Perilipin2用于脂肪細胞分化；Apo用于脂質運輸。 圖6 轉錄組學分析揭示的PS-NPs慢性暴露對PPAR信號通路的調控示意圖
綜上所述，本研究通過綜合分析，從分子、細胞和組織水平研究了PS-NPs慢性暴露對黃鱔的毒理學效應和機制。GO和KEGG富集分析確定了對刺激的反應、氧化還原過程以及凋亡途徑、化學致癌-活性氧、非酒精性脂肪性肝（NAFLD）的顯著關聯，指出PS-NPs在肝臟生物生理功能和相關細胞信號傳導中的有害干擾。具體而言，隨著暴露濃度的升高，ROS爆發誘發Keap1-Nrf2信號傳導，抑制抗氧化防御基因（SOD、CAT、GPx、GST等）和CYP450家族基因的表達，同時上調Hsp家族基因。除MFO活性升高外，SP水平和T-AOC活性均下降。ROS、MDA和8-OHdG水平升高引起的氧化損傷、脂質過氧化和遺傳毒性進一步導致肝臟組織病理學明顯缺陷，以及GPT、GOT、AKP、ACP和LDH等功能指標的下降。此外，隨著Cytc、Casps表達和活性的增強，p53信號被激活，加劇了肝細胞的凋亡。還有PPAR信號傳導失調誘導肝組織中TG、TC和HIS水平升高以及脂質脂肪變性。研究結果揭示了MPs誘導肝毒性的物理化學和分子機制，并強調了淡水養殖中MPs的生態風險評估。
參考文獻： Lv W, Gu H, He D, Liu Z, Yao C, Huang W, Yuan Q, Zhou W. Polystyrene nanospheres-induced hepatotoxicity in swamp eel (Monopterus albus): From biochemical, pathological and transcriptomic perspectives. Sci Total Environ. 2023 Oct 1;893:164844.
