2023-08-29
《Advanced Science》
影響因子：15.1
文章題目：Chlorogenic Acid Ameliorates Post-Infectious Irritable Bowel Syndrome by Regulating Extracellular Vesicles ofGut Microbes
技術手(shou)段：16s；代謝(xie)組(zu)；蛋白組(zu)
南昌大學第二附屬醫院在《Advanced Science》上發表了綠原酸通過調節腸道微生物的細胞外囊泡改善感染后腸易激綜合癥。
本研究的蛋白組、代謝組和16s的測序及部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
感染后腸易激綜合征(PI-IBS)發生于急性感染性腹瀉后，其發病機制可能與生物失調有關。人類腸道復雜的微生物群直接或間接地影響著宿主的健康。本文研究了綠原酸(CGA)在緩解大鼠PI-IBS中的作用，這是一種具有多種藥理特性的天然化合物。直腸給藥CGA通過調節腸道菌群及其代謝產物緩解PI-IBS，闡明腸道菌群在PI-IBS發病機制中起關鍵作用。添加CGA顯著提高了糞便中產酸擬桿菌的豐度和甘氨酸水平。原核細胞和真核細胞之間的生物信號交換主要是通過細胞外囊泡(EVs)的分泌，甘氨酸結構改變Bacteroides acidifaciens 胞外囊泡（EVs)并富集胞外囊泡中的功能蛋白;甘氨酸誘導的EVs通過減輕腸道臟器炎癥和超敏反應，維持黏膜屏障功能從而減輕PI-IBS。因此，CGA通過腸道微生物群及其代謝產物介導來緩解PI-IBS。本研究提出了一種腸道微環境與宿主之間信號交換的新機制。
技術路線
研究結果
1. PI-IBS大鼠腸道菌群紊亂的觀察
構(gou)建(jian)大鼠(shu)PI-IBS模型(xing)，發現PI-IBS大鼠(shu)，體重顯(xian)著(zhu)(zhu)降低、內臟敏感性增(zeng)加(圖(tu)1D)。白細(xi)胞介素(IL)?1??、IL-6和(he)腫瘤壞死因子(zi)(TNF)-??的(de)表達在(zai)PI-IBS大鼠(shu)(M組)顯(xian)著(zhu)(zhu)升(sheng)高(圖(tu)1E-J)。aa刺激大鼠(shu)肌球蛋(dan)白輕鏈(lian)激酶(MLCK)和(he)磷(lin)酸化肌球蛋(dan)白輕鏈(lian)(p-MLC)的(de)上調(diao)和(he)腸(chang)上皮TJ蛋(dan)白(ZO-1, occludin)的(de)下調(diao)(圖(tu)1K,L)。PI-IBS大鼠(shu)腸(chang)道通透(tou)性增(zeng)強(圖(tu)1M)。
通過16S rRNA基因測序，探討了正常組(C)和PI-IBS組的腸道菌群組成的差異。在門水平上，兩組糞便微生物群樣本中Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria均為優勢門；在屬水平上，兩組均以Lactobacillus、Ruminococcaceae和Lachnospiraceae為主；在物種水平上，B. acidifaciens, Akkermansia muciniphila和Pseudomonas xiamenensis 在PI-IBS組中減少，而Staphylococcus lentus的豐度顯著增加(圖1P-R)。上述結果揭示，4%AA聯合束縛應激可導致大鼠內臟敏感、炎癥反應、腸道黏膜屏障損傷和腸道菌群紊亂。
圖1直腸給藥(yao)AA誘(you)導大鼠PI-IBS并引起腸道菌(jun)群紊亂
2、直腸給藥CGA減輕AA誘導的大鼠PI-IBS
為研(yan)究CGA的作用，PI-IBS大(da)鼠(shu)直(zhi)腸(chang)給藥CGA 1周。與(yu)PI-IBS大(da)鼠(shu)(M組(zu))相比，CGA治(zhi)療后顯著減輕PI-IBS大(da)鼠(shu)內臟敏(min)感性、炎癥反應(ying)及黏(nian)膜損傷（圖2）。
圖2 直腸給藥CGA減輕AA誘導的大鼠PI-IBS
3、CGA糞菌移植(FMT)減輕大鼠PI-IBS癥狀
通過(guo)將PI-IBS大(da)鼠(shu)直腸(chang)(chang)給藥后的糞(fen)(fen)便菌(jun)(jun)(jun)群移植給受體(ti)大(da)鼠(shu)來驗證CGA暴露的腸(chang)(chang)道(dao)菌(jun)(jun)(jun)群對PI-IBS的影(ying)響(xiang)。與(yu)(yu)正常大(da)鼠(shu)（KC）和給藥CGA（KT）組(zu)相比(bi)，PI-IBS糞(fen)(fen)便（KM）組(zu)體(ti)重下降(圖(tu)3B)，內臟(zang)敏感性升高(圖(tu)3C)。炎癥(zheng)細胞浸潤(run)了KM組(zu)的結腸(chang)(chang)組(zu)織(圖(tu)3D)。與(yu)(yu)KM組(zu)相比(bi)，KC組(zu)FMT后癥(zheng)狀有所緩(huan)解，其中(zhong)KT組(zu)癥(zheng)狀改善最為顯著。結果表(biao)明，CGA處理(li)大(da)鼠(shu)的糞(fen)(fen)便移植可抑制PI-IBS模(mo)型中(zhong)內臟(zang)敏感性增加、炎癥(zheng)反(fan)應和腸(chang)(chang)黏(nian)膜(mo)屏障受損。因此，CGA對PI-IBS模(mo)型的緩(huan)解作用可能是通過(guo)調節腸(chang)(chang)道(dao)菌(jun)(jun)(jun)群或其代謝(xie)產物來介導的。
圖3 CGA-FMT減輕大鼠PI-IBS癥狀
4、CGA挽救了PI-IBS大鼠腸道產酸擬桿菌的損失和甘氨酸水平
通過對大鼠糞便微生物進行16S rRNA基因測序法。發現在門水平上, Firmicutes, Bacteroidetes和 Proteobacteria是糞便微生物群樣本中的優勢門(圖4E)。在屬水平上，糞便微生物群以Muribaculaceae, Lactobacillus和 Prevotella為主(圖4F)。在物種水平上，Lactobacillus intestinalis, L. reuteri,和 Allobaculum stercoricanis 是糞便微生物群中的優勢種(圖4G)。
通過對PI-IBS和(he)(he)CGA處(chu)理(li)的(de)(de)大鼠糞便樣本進行了非靶向代(dai)(dai)謝(xie)組學分(fen)析。在PI-IBS大鼠中鑒(jian)定出(chu)了24種代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)。10種表(biao)(biao)達下(xia)調，14種表(biao)(biao)達上調(圖(tu)4I)。KEGG富集(ji)結果(guo)表(biao)(biao)明，這(zhe)些(xie)代(dai)(dai)謝(xie)產物(wu)主要(yao)參(can)與(yu)氨(an)基酸(suan)相關代(dai)(dai)謝(xie)，包括纈氨(an)酸(suan)、亮氨(an)酸(suan)和(he)(he)異亮氨(an)酸(suan)的(de)(de)生物(wu)合成和(he)(he)降解 (圖(tu)4J)。對24種代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)進行分(fen)類(lei)，發現17.376%、16.667%和(he)(he)15.957%的(de)(de)代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)分(fen)別為脂(zhi)類(lei)、碳水化合物(wu)和(he)(he)氨(an)基酸(suan)(圖(tu)4K)。進一步分(fen)析了兩組間顯著不同水平的(de)(de)氨(an)基酸(suan)，發現CGA處(chu)理(li)的(de)(de)大鼠與(yu)PI-IBS處(chu)理(li)的(de)(de)大鼠相比，甘氨(an)酸(suan)含量顯著增加。這(zhe)些(xie)結果(guo)表(biao)(biao)明，CGA直腸(chang)給藥改善了腸(chang)道代(dai)(dai)謝(xie)產物(wu)的(de)(de)組成，特別是(shi)提(ti)高了甘氨(an)酸(suan)水平。
圖4 CGA增加了PI-IBS大鼠腸道產酸擬桿菌的豐度和甘氨酸水平
5、甘氨酸誘導的EVs (GEVs)恢復體外結腸上皮屏障功能
為了進一步研究EVs在微生物-宿主相互作用中的作用，將EVs與Caco-2細胞共孵育后，紅色dil信號被細胞吸收并在核周區積累(圖5B)。研究發現EVs抑制了Caco-2細胞中MLCK/p-MLC信號通路關鍵蛋白表達(圖5C)，促進了細胞間TJ蛋白(ZO-1和occludin)表達(圖5D)。免疫熒光技術在Caco-2細胞中也得到了相同的結果(圖5E和F)。此外，甘氨酸可以誘導B. acidfaciens EVs的形成，EVsv和GEVs均可進入Caco-2細胞，但GEVs比EVs更能促進腸上皮屏障功能的修復。
圖5 甘氨酸誘導的產酸擬桿菌 EVs對體外結腸上皮屏障功能的恢復作用
6、甘氨酸通過改變產酸擬桿菌EVs的蛋白譜改善大鼠PI-IBS癥狀
與EV組相比(bi)，GEVs顯著(zhu)減輕PI-IBS大鼠的(de)體重，增強了(le)內臟敏(min)感性（圖(tu)(tu)6B、C）。GEVs在降低促(cu)炎因(yin)子(zi)(IL-1??、IL-6和(he)TNF-??)水平(ping)方(fang)面(mian)的(de)作(zuo)用更顯著(zhu)(圖(tu)(tu)6F-K)。MLCK/p-MLC信號通路蛋白、腸上皮間質TJ蛋白(ZO-1和(he)occludin)和(he)血清FITC-dextran水平(ping)顯示，GEVs在增強粘(zhan)膜屏(ping)障完(wan)整性方(fang)面(mian)的(de)作(zuo)用更為(wei)明顯(圖(tu)(tu)6L-N)。
之(zhi)后(hou)，對非甘(gan)(gan)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)誘導(dao)(EVs)和(he)甘(gan)(gan)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)誘導(dao)(GEVs)的(de)EV進行了(le)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)組學分(fen)(fen)析，添加(jia)甘(gan)(gan)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)導(dao)致208個差異表(biao)達蛋(dan)白(bai)(DEPs)上調(diao)，183個差異表(biao)達蛋(dan)白(bai)下(xia)調(diao)(圖6Q)。GO富集分(fen)(fen)析表(biao)明(ming)(ming)，DEPs主要集中在(zai)細菌(jun)的(de)生(sheng)(sheng)物(wu)過程中。KEGG途徑分(fen)(fen)析表(biao)明(ming)(ming)，GEVs的(de)DEPs主要上調(diao)了(le)一些氨(an)(an)(an)(an)基酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)代(dai)謝相關途徑，包括丙氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、天冬氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)谷氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)代(dai)謝、泛酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)輔酶a的(de)生(sheng)(sheng)物(wu)合(he)(he)成(cheng)以(yi)及苯(ben)丙氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、酪氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)色氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)生(sheng)(sheng)物(wu)合(he)(he)成(cheng)，表(biao)明(ming)(ming)甘(gan)(gan)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)最(zui)有可(ke)能影響EVs代(dai)謝。此(ci)外(wai)，甘(gan)(gan)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)下(xia)調(diao)了(le)EVs中常見(jian)的(de)信(xin)號(hao)通(tong)(tong)路PI3K/Akt信(xin)號(hao)通(tong)(tong)路、FoxO信(xin)號(hao)通(tong)(tong)路和(he)MAPK信(xin)號(hao)通(tong)(tong)路-fly，并影響膽汁(zhi)(zhi)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)代(dai)謝，包括二(er)級(ji)膽汁(zhi)(zhi)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)生(sheng)(sheng)物(wu)合(he)(he)成(cheng)和(he)初級(ji)膽汁(zhi)(zhi)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)生(sheng)(sheng)物(wu)合(he)(he)成(cheng)，由此(ci)可(ke)見(jian)，與未誘導(dao)的(de)EVs相比，GEVs的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)組成(cheng)發生(sheng)(sheng)了(le)巨(ju)大(da)的(de)變化(hua)，最(zui)終改(gai)變了(le)其生(sheng)(sheng)物(wu)學功能。
圖6甘氨酸通過改變產酸擬桿菌EVs的蛋白譜改善大鼠PI-IBS癥狀
結 論
這項研究中(zhong)(zhong)，研究了腸(chang)(chang)道菌群(qun)在(zai)(zai)PI-IBS大鼠模(mo)型中(zhong)(zhong)的(de)(de)作用，證(zheng)實(shi)(shi)了CGA對(dui)PI-IBS癥(zheng)狀有緩解作用。使用16S核糖(tang)體(ti)RNA (rRNA)基因測(ce)序和(he)非靶(ba)向代(dai)(dai)謝組學篩選可能(neng)與CGA對(dui)PI-IBS癥(zheng)狀影響相關(guan)的(de)(de)候選細菌和(he)代(dai)(dai)謝物，并通(tong)過候選細菌(B. acidifaciens)和(he)代(dai)(dai)謝物(glycine)移植驗(yan)證(zheng)結果(guo)。體(ti)外實(shi)(shi)驗(yan)表明(ming)，細菌EVs可能(neng)是(shi)B. acidfaciens和(he)甘氨酸之間的(de)(de)潛在(zai)(zai)聯系(xi)。最(zui)后(hou)，確定腸(chang)(chang)道菌群(qun)產生的(de)(de)EVs在(zai)(zai)PI-IBS大鼠的(de)(de)炎癥(zheng)反(fan)(fan)應、腸(chang)(chang)道內臟超敏反(fan)(fan)應和(he)粘膜屏障功能(neng)的(de)(de)發(fa)展中(zhong)(zhong)發(fa)揮調節作用，是(shi)由特(te)定的(de)(de)代(dai)(dai)謝物誘(you)導的(de)(de)。對(dui)非甘氨酸誘(you)導(EVs)或甘氨酸誘(you)導(GEVs)的(de)(de)EV進行(xing)了蛋白質組學分(fen)析，證(zheng)明(ming)了甘氨酸誘(you)導的(de)(de)產酸擬(ni)桿菌 EV可以緩解PI-IBS癥(zheng)狀并進入(ru)腦組織(zhi)發(fa)揮潛在(zai)(zai)的(de)(de)調節作用（圖7）。
原文索引(yin)：
Zheng, C., Zhong, Y., Zhang, W., Wang, Z., Xiao, H., Zhang, W., Xie, J., Peng, X., Luo, J., Xu, W., Chlorogenic Acid Ameliorates Post-Infectious Irritable Bowel Syndrome by Regulating Extracellular Vesicles of Gut Microbes. Adv. Sci. 2023, 2302798. //doi.org/10.1002/advs.202302798
