2023-09-04
《Science of the Total Environment》 影響因子：9.800 近日，上海交通大學醫學院在微生物基因組領域的《Science of the Total Environment》發表最新研究成果！本研究針對分離得到的大腸桿菌基因組進行研究，發現一個具有193kb保守區域的tet（X4）陽性質粒，其可以在各種細菌物種和來源之間轉運，具有宿主間轉移和時空傳播的能力，對公眾健康構成重大威脅。 本研(yan)究的細菌基因(yin)組測序由上海派森諾生(sheng)物科技股份有限公(gong)司(si)完(wan)成。 研究背景 抗生素耐藥性被世界衛生組織視為全球十大公共衛生威脅之一，每年有70多萬人死于抗微生物感染。73%的抗菌藥物在食用動物中的使用量是人類臨床試驗的3倍以上，抗生素的誤用和濫用導致動物體內頻繁出現多重耐藥細菌。研究表明，在不同的動物中發現了抗生素耐藥基因，并且這些基因可以從動物傳播給人類，其中在動物和人類中出現的質粒介導的替加環素耐藥基因tet(X3-X6)引起了重點關注。然而，迄今為止，上海市動物源性腸桿菌中tet(X4)流行率及其質粒的綜合監測仍然有限。本研究從上海地區652株食源性動物大腸桿菌中篩選出5株耐替加環素大腸桿菌，對其進行基因組測序和生物信息學分析發現，除tet(X4)外，p193k家族的其他成員在其他國家還具有其他至關重要的ARGs，這表明該高危質粒家族在各國廣泛流行。 研究材料與方法 1、實驗材料(liao)：從(cong)上海(hai)市的(de)5個區(qu)的(de)養殖場篩選(xuan)得(de)到652株(zhu)(zhu)大腸桿菌菌株(zhu)(zhu)，其中(zhong)包括246株(zhu)(zhu)來自雞、304株(zhu)(zhu)來自豬和102株(zhu)(zhu)來自牛。 2.測(ce)序平(ping)臺：Illumina NovaSeq + Pacbio Sequel II 3.分析內容(rong)：藥敏實(shi)驗、質粒(li)(li)(li)接合實(shi)驗、質粒(li)(li)(li)穩定性實(shi)驗、細菌(jun)基因組完成圖測(ce)序、MLST分析(xi)(xi)、質粒(li)(li)(li)復制子類型分析(xi)(xi)、質粒(li)(li)(li)遺傳背景分析(xi)(xi)、系統發育(yu)樹構建等； 研究結果 上海地區tet（X4）陽性大腸桿菌的耐藥性及其他特征分析 本研究(jiu)從2018-2021年，對來源(yuan)于食用(yong)動物中分離得到的(de)(de)(de)(de)652株(zhu)大腸(chang)桿(gan)菌進行了藥敏實驗，對其中的(de)(de)(de)(de)來源(yuan)于健康豬的(de)(de)(de)(de)對替加環素具有耐藥性的(de)(de)(de)(de)菌株(zhu)進行進一步(bu)研究(jiu)。MLST分析顯示，這五株(zhu)大腸(chang)桿(gan)菌被細分為四(si)個(ge)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)ST。 基于高通量測序，對四種大腸桿菌菌株的完整染色體和質粒進行了詳細表征（圖1B-C）。這四個tet（X4）陽性菌株均存在一個幾乎完全相似的攜帶tet（X4）的質粒，并且我們研究中的tet（X4）陽性質體的大小都接近193kb，因此縮寫為p193ktetX4。令人驚訝的是，除了tet（X4）外，四個p193k-tetX4還共同攜帶一些常見的ARGs，包括氯霉素（floR）、氨基糖苷類（aadA22）和林可酰胺（lnu（G）），以及p19Y2-tetX4和p20Y26-tet4中的特異性qnrS1。此外，最小的184kb p20Y2-tetX4在blaTEM-1B和qnrS1中不存在，插入序列（IS2和△ISCR2）和幾種假設的蛋白質（圖1B）。 圖1 分離得到的五株陽性豬源性大腸桿菌菌株具有四種tet（X4）信息圖 tet（X4）陽(yang)性質粒（pTetX4s）的全球流行(xing)率 截至2022年8月，共發現151個tet（X4）陽性質粒（pTetX4s）的完整基因組序列。這些質粒分布在橫跨四大洲的十個國家，并在中國大量傳播，只有24株來自其他國家，包括巴基斯坦、美國和土耳其（圖2A）。生成了一個具有九個顏色編碼簇的ML系統發育樹，以研究151個pTetX4s的進化關系（圖2B），發現來自不同來源、地理位置和細菌宿主的pTetX4的聚類成不同簇。 有趣的是，34個p193k-tetX4完全起源于中(zhong)(zhong)國(guo)（圖2C）。此外，這34種質粒不僅在(zai)大腸桿菌(jun)(jun)（61.76%）中(zhong)(zhong)發現，而且在(zai)克雷伯菌(jun)(jun)屬（17.65%）、腸桿菌(jun)(jun)屬（8.82%）、檸檬酸桿菌(jun)(jun)屬（5.88%）等中(zhong)(zhong)也發現（圖2B）。總體(ti)而言，這些(xie)結果表明(ming)p193k-tetX4具有宿主間(jian)轉移(yi)和時空傳播的能(neng)力，但僅在(zai)中(zhong)(zhong)國(guo)檢(jian)測到，占中(zhong)(zhong)國(guo)pTetX4的26.7%，這表明(ming)該(gai)質粒家族極有可能(neng)在(zai)中(zhong)(zhong)國(guo)流行，尤(you)其是在(zai)廣東省（n=6）和廣西省（n=6）（圖2C）。 圖2 tet（X4）陽性質粒（pTetX4s）的全球分布 攜帶多種ARGs的p193k質粒家族的廣泛存在 為了進一(yi)步(bu)研究(jiu)類似(si)于(yu)p193k的(de)質粒(li)的(de)流(liu)行，在NCBI nr數據庫中(zhong)基于(yu)BLASTn，鑒定了154個(ge)質粒(li)（與p19Y2-tetX4至(zhi)少(shao)99%的(de)同一(yi)性和70%的(de)覆蓋率）。通過探索每(mei)個(ge)質粒(li)的(de)復制子類型、ARGs和起源（圖3），所有(you)(you)p193k都具有(you)(you)獨特的(de)融(rong)合質粒(li)，包(bao)括(kuo)至(zhi)少(shao)兩個(ge)拷貝的(de)IncFIA（HI1）、IncHI1A和IncHI1B（R27），占(zhan)p193k家(jia)族中(zhong)總(zong)質粒(li)復制子的(de)44.81%（69/154）。在從23個(ge)國家(jia)獲得的(de)154個(ge)p193k中(zhong)，中(zhong)國（n=54）、孟(meng)加拉國（n=22）和加拿大(da)（n=13）占(zhan)大(da)多數。大(da)腸桿(gan)菌屬（n=75）是最常見的(de)細(xi)菌宿(su)主，其次(ci)是沙門氏(shi)菌屬（n=59）和克雷伯菌屬（n=9）。 除了tet（X4）（n=34）外，這154個p193k還攜帶許多ARG，包括aph、sul、qnrS、flor、mph、fosA、lnu（G）等。還鑒定了至關重要的ARG，如粘菌素抗性基因mcr（n=12）、碳青霉烯抗性基因blaNDM（n=6）等（圖3）。這些ARG對幾種重要的抗菌藥物具有耐藥性，對總共16類抗菌藥物產生耐藥性。除了來源不明的14個p193k序列外，其余序列來自豬（n=39）、雞（n=10）、牛（n=10）。值得注意的是，p193k家族的主要來源是從人類中分離出來的，這表明它經常在動物和人類之間轉移，并對公眾健康構成重大威脅。 圖3 質粒復制子類型、ARGs和來源在全球154 p193k家族成員的質粒ML樹中的分布 p193k家族關鍵ARGs獨特的遺傳環境 作為193k-tet（X4）陽性質粒中最普遍的IncFIA（HI1）/HI1A/HI1B（R27）復制子類型，比較了其不同宿主、來源和地理區域質粒的線性遺傳結構（圖4A）。發現tet（X4）上有一個22kb的保守基因組區域。值得注意的是，從雞中收集的pSY3626_190k_tetX中tet（X4）的遺傳環境與人源性pE-T306-tetX4的遺傳環境高度相似（圖4A）。此外，一個豬克雷伯菌質粒pTKPN_3-186 k-tetX4也與大腸桿菌廢水質粒pHT1–1相似，表明p193k-tetX4已在動物、環境和人類之間傳播。 對mcr、blaNDM和blaOXA-9的遺傳環境和IS特征進行了廣泛的研究（圖4）。含有mcr-1的質粒主要來自中國和東南亞國家（包括馬來西亞和新加坡），來源（豬、雞、蔬菜和人類），以及細菌宿主（埃希氏菌屬、克雷伯菌屬和沙門氏菌屬）不同（圖4）。同時，除了人類和未知來源的blaOXA外，其余含有關鍵AMR基因的p193k具有不同的來源，表明高風險p193k可能在動物、環境、以及人類中廣泛傳播。 圖4p193k和其他pTetX4中tet（X4）的特殊遺傳背景分析圖 193kb tet（X4）陽性質粒和菌株基因組的系統發育分析 對來自203個菌株共計203193kb tet（X4）的完整陽性質粒（p193k-tetX4）或質粒相關序列，構建了ML系統發育樹（圖6A），分為4個聚類譜系（I-IV），表明其可能來源于中國的大腸桿菌菌株S752。譜系IV是最常見的聚類（85.22%），包括173個分離株。同時，譜系IV包括來自動物（n=143）、人類（n=18）和環境（n=9）的170個菌株。結果表明，p193k-tetX4已在不同的人類、動物甚至環境來源以及細菌物種之間廣泛傳播 更重要的(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)，對比例最大的(de)(de)(de)(de)(de)大腸(chang)桿菌菌株進行了基因(yin)組(zu)(zu)水平的(de)(de)(de)(de)(de)系(xi)統(tong)發(fa)(fa)育分析。生成了包含180個(ge)攜帶p193k-tetX4的(de)(de)(de)(de)(de)大腸(chang)桿菌基因(yin)組(zu)(zu)序列的(de)(de)(de)(de)(de)ML系(xi)統(tong)發(fa)(fa)育樹(shu)，聚類為(wei)六(liu)個(ge)譜系(xi)（圖第6B段），主(zhu)要為(wei)第六(liu)譜系(xi)，占總(zong)數的(de)(de)(de)(de)(de)82.22%。值得注意的(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)，來自(zi)不同(tong)來源的(de)(de)(de)(de)(de)菌株被(bei)發(fa)(fa)現是(shi)緊密(mi)相連的(de)(de)(de)(de)(de)，如圖6A-B所示，20Y26與豬品(pin)系(xi)HUN49密(mi)切相關，并聚集(ji)在(zai)同(tong)一(yi)譜系(xi)中。在(zai)這里，本研究中攜帶p193k-tetX4的(de)(de)(de)(de)(de)四(si)個(ge)大腸(chang)桿菌菌株聚集(ji)在(zai)ML系(xi)統(tong)發(fa)(fa)育樹(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)主(zhu)要分支內(nei)。 圖5基于p193k-tetX4單拷貝核心SNPs的ML系統發育樹分析 研究結論 本研究在上海地區分離得到4種不同ST型的對替加環素耐藥的大腸桿菌，并發現了1個193kb的攜帶tet(X4)的質粒。pTetX4的全球流行病學揭示了p193k-tetX4質粒復制子類型的國際分布、廣泛的宿主范圍和多樣性。然后，鑒定了來自NCBI的p193k家族的154個成員，對質粒復制子類型和ARGs的研究表明，p193k家族是ARGs重要的庫。許多ARG的共存表明了廣泛使用的、至關重要的抗生素所施加的共同選擇的壓力。此外，系統發育研究表明，p193k-tetX4可以在不同的細菌種類和來源之間轉運。因此，在許多人類-動物-環境光譜和細菌物種中，對高危質粒如p193k進行持續的基于健康的監測是至關重要的。 如需(xu)進(jin)一(yi)步討論，歡迎發郵件或者致電(dian)我(wo)們喲（郵箱地址：microsupport@doudin.cn，聯系(xi)電(dian)話：021-80118168-8617）！ 文章索引：Li M., Zhang HR., Zhang WG., et al. One global disseminated 193 kb high-risk hybrid plasmid harboring tet(X4), mcr or blaNDM threatening public health [J].Sci Total Environ. 2023.doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.162807.
