一、研究背景

天(tian)然骨(gu)組(zu)織的(de)(de)(de)微觀結(jie)(jie)構中(zhong)，堅實(shi)的(de)(de)(de)無機成(cheng)分(羥(qian)基磷灰石)主(zhu)要負責支撐、保(bao)護(hu)和(he)(he)承(cheng)重(zhong)，而柔軟的(de)(de)(de)有(you)機成(cheng)分（膠原纖維，多糖）在(zai)干(gan)細(xi)胞的(de)(de)(de)增(zeng)殖和(he)(he)遷移中(zhong)起(qi)著重(zhong)要作(zuo)用。因此，有(you)效地模(mo)(mo)擬天(tian)然骨(gu)軟硬結(jie)(jie)合的(de)(de)(de)雜(za)化的(de)(de)(de)結(jie)(jie)構與(yu)功能，有(you)助于調控(kong)干(gan)細(xi)胞命運來改(gai)善骨(gu)再生進程。3D打(da)印(yin)技術可以用于組(zu)織工程支架結(jie)(jie)構的(de)(de)(de)精確控(kong)制，特別是創建有(you)序孔隙和(he)(he)用戶自定義結(jie)(jie)構，被廣泛(fan)應用于組(zu)織工程領域。然而，目(mu)前(qian)以PCL，PLA等為主(zhu)的(de)(de)(de)擠出式3D打(da)印(yin)支架難(nan)(nan)以提(ti)供組(zu)織重(zhong)塑過(guo)程中(zhong)長期穩定的(de)(de)(de)營(ying)養供給，同時其表面缺(que)乏活性(xing)配體，這會(hui)導(dao)致無效的(de)(de)(de)細(xi)胞粘附和(he)(he)下游細(xi)胞事(shi)件，難(nan)(nan)以模(mo)(mo)擬骨(gu)組(zu)織再生過(guo)程所需的(de)(de)(de)生理微環(huan)境。因此尋(xun)找理想(xiang)的(de)(de)(de)骨(gu)再生性(xing)植入(ru)物仍然是臨床上(shang)一個(ge)持(chi)續的(de)(de)(de)挑戰。

二、技術路線

三、研究內容

利(li)用多巴胺介導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化(hua)學(xue)整(zheng)合(he)(he)，將仿(fang)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)胞外基(ji)質(zhi)凝膠(jiao)修(xiu)(xiu)飾在聚多巴胺涂(tu)層(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)3D打印PCL支(zhi)架(jia)(jia)(jia)中(zhong)，構建了軟(ruan)-硬結(jie)(jie)(jie)合(he)(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)活性(xing)(xing)骨修(xiu)(xiu)復體(ti)（BM-g-DPCL，圖1A）。采用原子力(li)顯微(wei)鏡(jing)（AFM）和掃描電鏡(jing)（SEM）測量了表(biao)面(mian)形(xing)貌(mao)和粗糙(cao)度，發現DPCL表(biao)面(mian)粗糙(cao)度和表(biao)面(mian)高度均高于未涂(tu)層(ceng)(ceng)支(zhi)架(jia)(jia)(jia)（圖1B-D），而PCL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)水接觸角(jiao)顯著(zhu)(zhu)高于DPCL（圖1E）。DPCL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)親水性(xing)(xing)和粗糙(cao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面(mian)可能(neng)促進(jin)(jin)細胞和蛋白質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)粘附(fu)。此(ci)外，DPCL纖維(wei)表(biao)面(mian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PDA顆(ke)粒也顯著(zhu)(zhu)促進(jin)(jin)了鈣(gai)離子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)螯合(he)(he)作用，并呈現出更強(qiang)烈的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)綠色熒光，暗示潛在的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)礦物沉積能(neng)力(li)（圖1F-I）。熱(re)重分(fen)析(xi)曲(qu)線和差(cha)(cha)示掃描量熱(re)分(fen)析(xi)結(jie)(jie)(jie)果(guo)（圖1J-L）顯示，BM-g-DPCL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)高變(bian)性(xing)(xing)溫度為(wei)(wei)402℃，相對(dui)而言，PCL為(wei)(wei)338℃，DPCL為(wei)(wei)345℃，說(shuo)明兒茶酚(fen)誘導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)多重鍵合(he)(he)反應增強(qiang)了支(zhi)架(jia)(jia)(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)熱(re)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)。此(ci)外，生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物活性(xing)(xing)基(ji)質(zhi)約占BM-g-DPCL總重量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)22%。低倍鏡(jing)下PCL和DPCL支(zhi)架(jia)(jia)(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顯微(wei)結(jie)(jie)(jie)構無明顯差(cha)(cha)異（圖1M-N）。然而，BM-g-DPCL支(zhi)架(jia)(jia)(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)孔(kong)隙結(jie)(jie)(jie)構特征發生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)了明顯變(bian)化(hua)。膠(jiao)原纖維(wei)和多糖(tang)透明質(zhi)酸形(xing)成(cheng)了大量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)孔(kong)（多為(wei)(wei)100-200μm，圖1O），這些微(wei)孔(kong)均勻(yun)分(fen)布在整(zheng)個3d打印支(zhi)架(jia)(jia)(jia)中(zhong)，以高度仿(fang)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)軟(ruan)硬結(jie)(jie)(jie)構構建骨修(xiu)(xiu)復體(ti)。

圖1BM-g-DPCL支架的制備與表征(zheng)

共(gong)培養3、7和14天后(hou)，分別進(jin)行(xing)活/死(si)染(ran)色(se)(se)和細(xi)(xi)(xi)(xi)胞骨(gu)架(jia)染(ran)色(se)(se)（圖2A-B），以(yi)評(ping)估細(xi)(xi)(xi)(xi)胞存活狀態和形(xing)態。根據激光掃描共(gong)聚焦顯(xian)微(wei)鏡(jing)(CLSM)的(de)活/死(si)染(ran)色(se)(se)圖像(xiang)，支(zhi)(zhi)架(jia)中幾乎(hu)沒有(you)可見(jian)的(de)死(si)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞，表明(ming)支(zhi)(zhi)架(jia)與rBMSCs具有(you)良好的(de)生(sheng)(sheng)物(wu)相容性。由于只有(you)支(zhi)(zhi)架(jia)的(de)內(nei)部(bu)纖維能夠提供粘附位點，因此在14 d后(hou)，PCL和DPCL支(zhi)(zhi)架(jia)也可以(yi)看(kan)到明(ming)顯(xian)的(de)定(ding)向生(sheng)(sheng)長(chang)以(yi)及內(nei)部(bu)纖維的(de)生(sheng)(sheng)長(chang)，說(shuo)明(ming)BM-gDPCL為細(xi)(xi)(xi)(xi)胞生(sheng)(sheng)長(chang)提供了(le)優越(yue)的(de)微(wei)環境。細(xi)(xi)(xi)(xi)胞骨(gu)架(jia)染(ran)色(se)(se)證實所有(you)支(zhi)(zhi)架(jia)均支(zhi)(zhi)持細(xi)(xi)(xi)(xi)胞的(de)擴散。

CCK-8檢(jian)測（圖2C）結(jie)果顯示，與PCL相(xiang)比，在BM-g-DPCL中引入PDA涂層和(he)(he)生物活性(xing)水(shui)凝膠(jiao)增(zeng)(zeng)強了(le)rBMSCs的(de)粘附和(he)(he)增(zeng)(zeng)殖。21天后，定量測量成(cheng)骨（Ocn、Alp、Opn和(he)(he)Bmp2）和(he)(he)基(ji)質重塑相(xiang)關(guan)（Col I和(he)(he)Vegf）基(ji)因(yin)的(de)表達(da)（圖2D-H）。BM-g-DPCL的(de)基(ji)因(yin)表達(da)水(shui)平高于DPCL和(he)(he)PCL。這些結(jie)果表明(ming)，BM-g-DPCL支架可以改善rBMSCs的(de)增(zeng)(zeng)殖、血管(guan)生成(cheng)和(he)(he)成(cheng)骨分化(hua)以及特異性(xing)基(ji)質分泌。

圖2 體外細胞的增殖和分化

通過(guo)跨(kua)孔模型證實支(zhi)架對rBMSCs體外遷(qian)(qian)移(yi)行(xing)為(wei)的影響(圖(tu)(tu)3A)。結果表(biao)明，BM-g-DPCL組(zu)比DPCL和PCL組(zu)有更多(duo)的rBMSCs向(xiang)trans-well的下腔遷(qian)(qian)移(yi)。半定量分(fen)析顯示，各(ge)處理(li)組(zu)均促進了(le)細胞遷(qian)(qian)移(yi)，且(qie)遷(qian)(qian)移(yi)細胞數量呈增加趨勢(shi)(BM-g-DPCL > DPCL > PCL > BK，圖(tu)(tu)3B,C)。醋酸溶解結晶紫在570 nm處的定量OD值(zhi)證實了(le)這一結果(圖(tu)(tu)3D)。rBMSCs遷(qian)(qian)移(yi)行(xing)為(wei)的改(gai)善可能是由于多(duo)酚或水凝膠吸附了(le)功能蛋白或因子(zi)。

7天后提(ti)取(qu)體內(nei)植入支架，以(yi)評估家兔(tu)顱骨缺(que)損部(bu)位(wei)(wei)內(nei)源性干(gan)細(xi)(xi)胞（ESCs）的(de)(de)募集情況（圖3E）。所有(you)的(de)(de)干(gan)細(xi)(xi)胞標(biao)記物（CD29和CD90，圖3F）在BM-gDPCL組(zu)(zu)中均(jun)有(you)顯(xian)著的(de)(de)陽性表達(da)，而(er)在PCL支架中幾(ji)乎(hu)沒有(you)可(ke)見的(de)(de)干(gan)細(xi)(xi)胞，說(shuo)明BM-g-DPCL支架可(ke)以(yi)刺(ci)激(ji)ESCs向(xiang)缺(que)陷區遷移(yi)。平均(jun)光密(mi)度（圖3G-H）證實(shi)了(le)最強的(de)(de)熒光發(fa)生在BM-g-DPCL組(zu)(zu)。同時，CD31可(ke)見陽性染色（圖3F）證實(shi)了(le)血管(guan)生長，ImageJ的(de)(de)半定量(liang)熒光強度分析顯(xian)示了(le)BM-g-DPCL的(de)(de)最佳特(te)征（圖3I）。簡而(er)言(yan)之，BM-g-DPCL支架可(ke)以(yi)招(zhao)募ESCs到缺(que)陷部(bu)位(wei)(wei)，并(bing)刺(ci)激(ji)早(zao)期血管(guan)生成。

圖3 干細胞在體內的遷移和體外的募集

生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)材料皮下植(zhi)(zhi)入為材料內部細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)提供(gong)(gong)了(le)適宜的(de)(de)微環境和(he)豐富的(de)(de)營養供(gong)(gong)應(ying)，保證(zheng)了(le)在(zai)(zai)明(ming)確的(de)(de)影響因素下，材料誘導成骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)分化(hua)(hua)和(he)干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)礦(kuang)(kuang)化(hua)(hua)沉(chen)(chen)積(ji)的(de)(de)效果得以(yi)顯(xian)(xian)(xian)現(xian)。在(zai)(zai)這里，使用皮下植(zhi)(zhi)入物(wu)來評估28天(tian)后BALB/c裸鼠(shu)體(ti)內異位(wei)礦(kuang)(kuang)化(hua)(hua)和(he)血(xue)(xue)管生(sheng)(sheng)(sheng)成的(de)(de)潛力(圖4A)。通(tong)過微型計算機斷層掃描(CT)在(zai)(zai)BM-g-DPCL支(zhi)(zhi)架(jia)上沉(chen)(chen)積(ji)了(le)最明(ming)顯(xian)(xian)(xian)的(de)(de)骨(gu)(gu)基(ji)(ji)質(zhi)(zhi)(圖4B)，骨(gu)(gu)礦(kuang)(kuang)物(wu)質(zhi)(zhi)密度(BMD)、骨(gu)(gu)體(ti)積(ji)/組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)積(ji)(BV /TV)和(he)骨(gu)(gu)表面積(ji)與(yu)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)積(ji)比(bi)(BS/TV)參數(shu)(shu)證(zheng)實了(le)這種(zhong)最佳的(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)礦(kuang)(kuang)化(hua)(hua)沉(chen)(chen)積(ji)趨勢(shi)(圖4C-E)。與(yu)相(xiang)對簡單的(de)(de)圓形(xing)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)分布相(xiang)反(fan)，CLSM顯(xian)(xian)(xian)示(shi)DPCL和(he)BM-gDPCL存(cun)在(zai)(zai)不同程度的(de)(de)交織(zhi)(zhi)(zhi)紡錘狀形(xing)態(圖4F)。SEM圖(圖4G)顯(xian)(xian)(xian)示(shi)纖維與(yu)基(ji)(ji)質(zhi)(zhi)交織(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)類骨(gu)(gu)磷灰石沉(chen)(chen)積(ji)較(jiao)多(BM-g-DPCL > DPCL > PCL)。HE和(he)Masson三色(se)(se)染(ran)(ran)色(se)(se)(圖4H-I)顯(xian)(xian)(xian)示(shi)BM-g-DPCL和(he)DPCL支(zhi)(zhi)架(jia)含(han)有細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(HE中(zhong)紫色(se)(se)點)和(he)骨(gu)(gu)基(ji)(ji)質(zhi)(zhi)(藍色(se)(se)纖維)，表明(ming)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)增殖和(he)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)礦(kuang)(kuang)化(hua)(hua)增強。CD31免(mian)疫染(ran)(ran)色(se)(se)的(de)(de)圖像和(he)半定量(liang)結(jie)果(圖4J-L)存(cun)在(zai)(zai)顯(xian)(xian)(xian)著差異。與(yu)PCL和(he)DPCL支(zhi)(zhi)架(jia)相(xiang)比(bi)，BM-g-DPCL支(zhi)(zhi)架(jia)中(zhong)出現(xian)的(de)(de)新生(sheng)(sheng)(sheng)血(xue)(xue)管數(shu)(shu)量(liang)更多。Runx2免(mian)疫染(ran)(ran)色(se)(se)也顯(xian)(xian)(xian)示(shi)，移植(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)促進了(le)所有組(zu)的(de)(de)骨(gu)(gu)形(xing)成，尤(you)其是BM-g-DPCL支(zhi)(zhi)架(jia)(圖4K-M)。綜上所述，這些結(jie)果表明(ming)BM-g-DPCL支(zhi)(zhi)架(jia)可(ke)以(yi)促進體(ti)內異位(wei)血(xue)(xue)管形(xing)成和(he)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)礦(kuang)(kuang)化(hua)(hua)。

圖4 裸鼠模型皮下植入各種支架后異位礦物沉積

HE和Masson染色(se)顯示，BM-g-DPCL組(zu)(zu)植(zhi)入12周后，支架(jia)底部形成明顯連續完(wan)整(zheng)的(de)(de)骨結構薄層(圖5A)。而PCL組(zu)(zu)和DPCL組(zu)(zu)僅修復了一小(xiao)部分缺損(sun)體積。與BM-g-DPCL致(zhi)密的(de)(de)再生界(jie)面(mian)相比，PCL和DPCL均存在宿主骨組(zu)(zu)織(zhi)與支架(jia)之(zhi)間(jian)的(de)(de)纖維組(zu)(zu)織(zhi)，阻礙了骨組(zu)(zu)織(zhi)的(de)(de)生長(圖5B、C)。

定量結(jie)果(guo)顯(xian)(xian)示(shi)(shi)，BM-gDPCL組(zu)(zu)(zu)骨體積/組(zu)(zu)(zu)織體積(BV /TV, 22.5±0.69%)顯(xian)(xian)著高于PCL和(he)DPCL組(zu)(zu)(zu)(圖5D-E)。此外，BM-g-DPCL組(zu)(zu)(zu)也顯(xian)(xian)示(shi)(shi)出最好的(de)(de)骨形態學參數(shu)(圖5F-G)，與上述HE和(he)Masson染色(se)結(jie)果(guo)一致，免疫組(zu)(zu)(zu)化染色(se)圖像(xiang)(圖5H-J)也均有證實，Image J顯(xian)(xian)示(shi)(shi)BM-g-DPCL組(zu)(zu)(zu)血管生(sheng)成(cheng)和(he)成(cheng)骨相關蛋白(bai)ANGPT、ColI、OPN和(he)Runx2表達增強(圖5K-N)。這些結(jie)果(guo)表明BM-g-DPCL支架在促進(jin)血管化和(he)長期骨再生(sheng)方面(mian)具有更大的(de)(de)潛力。

圖5 線粒體呼吸鏈復合物I（A）、II（B）、III（C）、IV（D）和V（E）的酶活性測定

為了在(zai)蛋白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)學水平(ping)上了解不同支架在(zai)加(jia)速成(cheng)骨(gu)過(guo)程中的(de)(de)作用，采用非標(biao)蛋白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)學方法(fa)獲得PCL、DPCL和(he)BM-g-DPCL組(zu)(zu)在(zai)12周時的(de)(de)蛋白(bai)(bai)組(zu)(zu)成(cheng)。通過(guo)主成(cheng)分(fen)(fen)(fen)分(fen)(fen)(fen)析、差異表(biao)(biao)達蛋白(bai)(bai)維(wei)恩圖和(he)聚(ju)類(lei)分(fen)(fen)(fen)析對(dui)三組(zu)(zu)樣本進(jin)(jin)行(xing)統計分(fen)(fen)(fen)析。結果表(biao)(biao)明，蛋白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)學數(shu)據可用于進(jin)(jin)一步分(fen)(fen)(fen)析。接(jie)下(xia)來，對(dui)差異表(biao)(biao)達蛋白(bai)(bai)(DEPs)進(jin)(jin)行(xing)火(huo)山圖分(fen)(fen)(fen)析(圖6A-B)。DPCL與(yu)PCL相(xiang)比有519個DEPs上調(diao)(diao)(diao)，137個DEPs下(xia)調(diao)(diao)(diao)，BM-g-DPCL與(yu)DPCL相(xiang)比有193個DEPs上調(diao)(diao)(diao)，170個DEPs下(xia)調(diao)(diao)(diao)。相(xiang)對(dui)于PCL組(zu)(zu)，DPCL組(zu)(zu)顯(xian)著促進(jin)(jin)了細胞結合、細胞對(dui)氧化應激的(de)(de)反應和(he)醌代(dai)謝過(guo)程（圖6C）。與(yu)DPCL組(zu)(zu)相(xiang)比，BM-g-DPCL組(zu)(zu)顯(xian)著促進(jin)(jin)了細胞外基質(zhi)的(de)(de)形成(cheng)、軸突的(de)(de)發育和(he)細胞結合（圖6D）。PDA涂(tu)層(ceng)（圖6E）增加(jia)了細胞粘(zhan)附和(he)干細胞發育，并隨后增強成(cheng)骨(gu)。BM-gDPCL通過(guo)促進(jin)(jin)細胞粘(zhan)附、血管(guan)生成(cheng)和(he)潛在(zai)的(de)(de)炎(yan)癥調(diao)(diao)(diao)節來加(jia)速成(cheng)骨(gu)（圖6F）。

     差異(yi)蛋白質熱圖及蛋白質互作網絡闡明(ming)了這一過程（圖G-J）。含有(you)生(sheng)物活(huo)性水凝膠的(de)BM-g-DPCL通過促(cu)進血管生(sheng)成(cheng)(cheng)(cheng)（MMP2、AGT、ITIH3、CSPG4）和(he)細(xi)胞外基質（ECM）形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)活(huo)性（FBLN1、ECM1、ECM2）以及骨重塑（SERPINH1、COL6A2、COL6A3）來(lai)促(cu)進骨生(sheng)成(cheng)(cheng)(cheng)。蛋白質組學數據分析與前期(qi)實驗結(jie)果(guo)一致，表明(ming)BM-g-DPCL組可通過整(zheng)合類ECM生(sheng)物活(huo)性水凝膠，加速整(zheng)合素/肽(tai)/因子(zi)結(jie)合募集ESCs，進而促(cu)進ECM的(de)構建(jian)和(he)形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)，進一步(bu)促(cu)進血管生(sheng)成(cheng)(cheng)(cheng)和(he)成(cheng)(cheng)(cheng)骨。

四、研究結論

本(ben)研究通(tong)過模仿骨基質的(de)軟硬結合結構(gou)，利用多巴胺介導(dao)的(de)仿生細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)外(wai)基質錨(mao)定聚(ju)多巴胺包(bao)被的(de)3DP PCL支(zhi)架(BM-g-DPCL)，構(gou)建了(le)一(yi)種化學(xue)(xue)鍵(jian)合結構(gou)。它促進(jin)了(le)干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)在體(ti)外(wai)的(de)遷移、增殖和(he)成(cheng)骨分化，并加速了(le)體(ti)內(nei)內(nei)源性干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)募集(ji)和(he)快速血管(guan)生成(cheng)。植(zhi)入后，能在骨組織與種植(zhi)體(ti)之間融合，誘導(dao)骨基質沉積。蛋白質組學(xue)(xue)證實細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)因(yin)子(zi)(zi)粘附、生物礦化、快速血管(guan)化和(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)外(wai)基質形成(cheng)是臨床尺寸兔(tu)顱骨缺損重(zhong)建滿意(yi)的(de)主要因(yin)素(su)。該策略(lve)為無生長因(yin)子(zi)(zi)/細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)骨再生支(zhi)架提供了(le)一(yi)種可(ke)選的(de)設計思(si)路(lu)。