2023-10-19
《Molecular Plant》
影響因子：27.5
中國科學院分子植物科學卓越創新中心陳曉亞院士團隊，在國際著名期刊《Molecular Plant》上發表單細胞轉錄組揭示棉(mian)花(hua)萜(tie)類(lei)化合物的生物合成及調控(kong)機(ji)制的研究成果。本研究的單(dan)細胞(bao)轉錄組(zu)測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
NO·01、研究背景 萜類(lei)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物(wu)(wu)是一(yi)類(lei)多樣化(hua)的(de)(de)(de)(de)代謝產物(wu)(wu)，自然(ran)存在(zai)的(de)(de)(de)(de)萜類(lei)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物(wu)(wu)超過(guo)50000種(zhong)。植物(wu)(wu)在(zai)應對不(bu)同(tong)環境時會合(he)(he)(he)(he)成不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)萜類(lei)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物(wu)(wu)，一(yi)些(xie)特殊的(de)(de)(de)(de)萜類(lei)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物(wu)(wu)在(zai)傳粉(fen)、種(zhong)子(zi)傳播(bo)和(he)防御(yu)等過(guo)程(cheng)中(zhong)發(fa)揮重要(yao)的(de)(de)(de)(de)作(zuo)用，它們的(de)(de)(de)(de)合(he)(he)(he)(he)成發(fa)生在(zai)植物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)特定(ding)器官。腺體存在(zai)于棉花(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)葉片、莖和(he)種(zhong)子(zi)中(zhong)，負責積累各種(zhong)非揮發(fa)性(xing)萜類(lei)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物(wu)(wu)（例如棉酚），這(zhe)些(xie)萜類(lei)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)合(he)(he)(he)(he)成源于甲羥(qian)戊酸途徑（mevalonate(MVA) pathway）。為了抵御(yu)植食性(xing)昆蟲的(de)(de)(de)(de)侵襲，棉花(hua)(hua)葉片釋放復雜的(de)(de)(de)(de)揮發(fa)性(xing)萜類(lei)。盡管一(yi)些(xie)研究已經報(bao)道了萜類(lei)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物(wu)(wu)合(he)(he)(he)(he)成酶(mei)和(he)轉(zhuan)錄(lu)調控因子(zi)的(de)(de)(de)(de)鑒定(ding)，然(ran)而不(bu)同(tong)萜類(lei)化(hua)合(he)(he)(he)(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)時空(kong)調控仍然(ran)缺乏清晰的(de)(de)(de)(de)認識。
NO·02、研究思路
NO·03、研究結果 結果1、scRNA-seq揭示棉花真葉單細胞表達圖譜 作者通過scRNA-seq 獲得(de)了(le)發育15天的棉花真(zhen)葉(xie)組織單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，共(gong)捕獲22163個高質量細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。通過聚類分(fen)群得(de)到14個clusters，通過marker基(ji)因注釋和原位雜交驗(yan)證鑒定到6種細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型(xing)：分(fen)別是葉(xie)肉細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（MCs）、表皮(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（ECs）、保衛(wei)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（GCs）、維管束細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（VCs）、增殖(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（PCs）和分(fen)泌型(xing)腺體細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（SGCs）。單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)表達圖譜揭示(shi)了(le)棉花真(zhen)葉(xie)的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)異質性，與葉(xie)片(pian)解剖學觀察的結果(guo)一(yi)致。 圖1. 陸地棉(mian)真(zhen)葉的單細胞轉(zhuan)錄(lu)圖譜(pu) 結果2、萜類化合物合成基因特異表達在腺體細胞（SGCs） GO富集分(fen)析顯示(shi)(shi)，腺(xian)(xian)體細(xi)(xi)(xi)胞（SGCs）特異(yi)表(biao)達(da)的(de)(de)(de)(de)marker基因富集到類異(yi)戊(wu)二烯生物合(he)成通路(lu)(lu)，表(biao)明腺(xian)(xian)體細(xi)(xi)(xi)胞（SGCs）具有活躍(yue)的(de)(de)(de)(de)次生代謝(xie)（圖(tu)2A）。原(yuan)位質譜顯示(shi)(shi)半棉酚(fen)、棉酚(fen)和(he)半棉酚(fen)酮等均(jun)在腺(xian)(xian)體中特異(yi)性積累(lei)（圖(tu)2B）。為了(le)確定棉酚(fen)合(he)成通路(lu)(lu)在葉片中的(de)(de)(de)(de)空間(jian)分(fen)布，作者在單細(xi)(xi)(xi)胞水平(ping)檢測了(le)棉酚(fen)合(he)成通路(lu)(lu)基因的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)模式，發現已知(zhi)棉酚(fen)合(he)成途(tu)徑及其上游(you)甲(jia)(jia)羥戊(wu)酸(suan)途(tu)徑(mevalonic acid pathway, MVA pathway)酶(mei)編碼(ma)基因均(jun)在棉花腺(xian)(xian)體細(xi)(xi)(xi)胞中特異(yi)表(biao)達(da)（圖(tu)2C），暗(an)示(shi)(shi)了(le)棉酚(fen)途(tu)徑和(he)上游(you)的(de)(de)(de)(de)甲(jia)(jia)羥戊(wu)酸(suan)途(tu)徑可能是受到共(gong)同調(diao)控。此外(wai)，4個編碼(ma)揮發性單萜(tie)和(he)倍半萜(tie)合(he)成的(de)(de)(de)(de)萜(tie)類合(he)酶(mei)基因（GhTPS1，GhTPS2，GhTPS3和(he)GhTPS6）同樣特異(yi)高(gao)表(biao)達(da)在腺(xian)(xian)體細(xi)(xi)(xi)胞（圖(tu)2D-E）。 圖2. 非揮發性和揮發性萜類在分泌型腺體細胞中合成 結果3、棉花HSFA4a和NAC42調控腺體細胞中萜類化合物合成 通過單細胞技術對腺體細胞類型的鑒定及特異表達基因的獲取為研究者提供了挖掘新調控因子的機會。作者結合單細胞和多組織轉錄組數據，精確鑒定到了兩個新的、特異表達在腺體細胞中的轉錄因子GoHSFA4a和GoNAC42（圖3A-B)。利用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術誘導GoHSFA4a和GoNAC42基因的轉錄后沉默，發現腺體發育不受影響，但MVP途徑的萜類化合物和MEP途徑的單萜化合物合成顯著減少（圖3C-E），相關基因表達也顯著降低（圖F）。進一步，作者利用PlantPAN 4.0預測GoHSFA4a和GoNAC42的順式作用元件，表明它們可能與MVA和棉酚合成途徑基因的啟動子區域結合。雙熒光素酶、EMSA和酵母單雜交實驗表明GoHSFA4a直接與HMGs、CYP736A196基因啟動子結合，而GoNAC42與HMGR和DH1基因啟動子結合（圖3G-J）。這些結果表明GoHSFA4a和GoNAC42通過激活特定的MVA和棉酚途徑基因調節棉酚型代謝物的生物合成。 圖3. GoHSFA4a和GoNAC42調控腺體細胞中萜類化合物合成 結果4、GoPGF直接調控GoHSFA4a和GoNAC42基因表達 GoPGF是棉花腺體發育和棉酚合成的重要調控基因，為了探究GoPGF與GoHSFA4a、GoNAC42的關系，作者檢測了GoPGF基因沉默葉片中GoHSFA4a、GoNAC42基因的表達，發現GoHSFA4a、GoNAC42基因的mRNA水平在GoPGF基因沉默組顯著減少（圖4A）。CHIP-seq分析顯示GoPGF直接結合到GoHSFA4a和GoNAC42的啟動子上（圖4B）。EMSA、酵母單雜交和雙熒光素酶實驗進一步驗證了CHIP-seq的結果（圖4C-E）。 圖4. GoHSFA4a和GoNAC42基因受GoPGF和逆境信號調控 結果5、GoHSFA4a和GoNAC42可能是重要的防御調控因子 植物在應對病原菌和植食性昆蟲侵襲時，萜類化合物作為一種植物抗毒素，其合成會增加。為了探究GoPGF-GoHSFA4a/GoNAC42調控模塊是否參與植物對病原菌和昆蟲的抵抗，作者分別檢測了大麗輪枝菌（Verticillium dahliae isolate V592）和棉鈴蟲侵襲的棉花葉片中三個基因的表達，發現GoHSFA4a、GoNAC42在侵襲組中葉片中表達量顯著升高，但GoPGF沒有升高的趨勢，暗示GoHSFA4a和GoNAC42在防御調控上具有更重要的功能。
NO·04、總 結 作者利用scRNA-seq技(ji)術(shu)建(jian)立(li)了(le)棉(mian)花真葉(xie)的單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)轉錄圖譜，鑒定到揮發性和非揮發性萜(tie)(tie)類(lei)代謝物合(he)成(cheng)的細(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型，結合(he)多組織轉錄組數據挖(wa)掘到兩(liang)個調控萜(tie)(tie)類(lei)化合(he)物合(he)成(cheng)的關鍵轉錄因子，確定了(le)它(ta)們的上、下游調控基因，在單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)水平上構建(jian)了(le)一條(tiao)調節萜(tie)(tie)類(lei)代謝物生(sheng)物合(he)成(cheng)的級聯轉錄調控網絡。
派森諾單細胞項目經驗 派森(sen)諾(nuo)生物(wu)具有(you)豐(feng)富的(de)(de)單細胞(bao)項目經驗(yan)，涵蓋人(ren)(ren)、鼠(shu)、猴、雞、豬(zhu)、羊、斑馬魚、團頭魴、鯽魚、鱖(gui)魚、蛙、蝌蚪、水稻、楊樹、小(xiao)麥、玉(yu)米(mi)、苜蓿、大豆、棉花、番茄、煙草、南瓜、小(xiao)青菜(cai)、胡蘿卜、川穹(qiong)、檀香、蘆葦(wei)、油桃、石斛、人(ren)(ren)參(can)、牛至(zhi)、金錢松、金銀花、桑葚、丹參(can)、工(gong)業大麻等模式及非(fei)模式物(wu)種(zhong)，涉及腫瘤、肝(gan)臟、肺、角膜(mo)(mo)、視網(wang)膜(mo)(mo)、皮(pi)膚、胃黏(nian)膜(mo)(mo)、血管、血液、心臟、回腸、脛骨、睪丸、肌腱、胚胎、植物(wu)根、莖(jing)、葉、芽、花序、花藥、果實、種(zhong)子等多種(zhong)組織類(lei)型，積累了豐(feng)富的(de)(de)細胞(bao)解離和分析經驗(yan)，助力更(geng)深、更(geng)廣的(de)(de)科(ke)研探索。
