2024-01-16
近日，中國農(nong)(nong)業科(ke)學(xue)院(yuan)茶(cha)葉(xie)研(yan)究所茶(cha)樹(shu)種質資源創新(xin)團隊(dui)在《Journal of Experimental Botany》發表(biao)新(xin)研(yan)究成果(guo)！本研(yan)究揭(jie)示了(le)(le)茶(cha)樹(shu)葉(xie)片白化性狀(zhuang)的主效數(shu)量性狀(zhuang)位點qChl-3，與(yu)鎂螯合酶I亞基(ji)（CsCHLI）的一個非同義多(duo)態性（G1199A）相(xiang)關。本研(yan)究揭(jie)示了(le)(le)茶(cha)樹(shu)葉(xie)片白化形成的分子機制以及葉(xie)綠素生物合成與(yu)氨基(ji)酸代(dai)謝之間(jian)的關系(xi)，推進了(le)(le)茶(cha)樹(shu)重(zhong)要(yao)農(nong)(nong)藝性狀(zhuang)的遺傳(chuan)分析。
本研究的(de)遺(yi)傳圖譜QTL定(ding)位、BSA定(ding)位、轉(zhuan)錄組測序分析均(jun)由上海派森諾生物(wu)科技(ji)股份有限公(gong)司完成。
PART 1研究背景
茶樹（Camellia sinensis）由于其特有的次生(sheng)(sheng)代謝(xie)產物(wu)，包括茶氨酸、類(lei)黃酮(tong)和(he)生(sheng)(sheng)物(wu)堿(jian)，具(ju)有重要(yao)的經濟和(he)健康益處(chu)。"白雞冠"（BJG）是中國著名(ming)(ming)的光敏(min)性葉綠(lv)素缺(que)陷（葉片白化）茶樹品(pin)種(zhong)，主要(yao)用(yong)于烏龍茶，因其獨特的表(biao)型和(he)香(xiang)氣(qi)而聞名(ming)(ming)。盡管對(dui)葉片白化茶樹植株的研究主要(yao)集中在基因表(biao)達調控上，但這一(yi)表(biao)型的遺(yi)傳基礎仍然不清(qing)楚。
本研(yan)究對葉(xie)綠素含量(liang)的數量(liang)性(xing)狀位點(dian)（QTL）進行分析，并(bing)鑒定了(le)(le)一(yi)個(ge)控制葉(xie)片白化表型的主(zhu)效QTL（qChl-3），與(yu)鎂螯合酶I亞基（CsCHLI）中的一(yi)個(ge)非同義單核苷(gan)酸多態性(xing)（SNP）相關(guan)。揭示了(le)(le)CsCHLI在調(diao)控茶(cha)葉(xie)褪綠過程中的作用，為了(le)(le)解葉(xie)綠素生(sheng)物合成與(yu)氨基酸代謝的關(guan)系提供(gong)了(le)(le)依據。
PART 2研究材料與方法
1.實驗材料：
‘龍(long)井43’為(wei)(wei)母(mu)本，‘白雞(ji)冠’為(wei)(wei)父本的F1雜交群體；以‘白雞(ji)冠’為(wei)(wei)輪(lun)回父本構建的BC1群體。
2.測序平臺：
Illumina NovaSeq
3.分析內容：
遺傳圖譜構建(jian)與(yu)QTL定位、BSA定位、轉錄組、蛋白代謝分析、酶(mei)學(xue)分析等
PART 3研究結果
1.葉綠素缺陷表型QTL的鑒定
在(zai)(zai)高光條件下，"白雞冠"（BJG）茶(cha)樹的(de)嫩(nen)芽表(biao)現出(chu)黃色(se)(se)葉(xie)片，葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)(lv)素(su)(su)(su)a、葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)(lv)素(su)(su)(su)b和葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)(lv)素(su)(su)(su)總(zong)量相(xiang)比于“龍井43號”（LJ43）顯著(zhu)較低。通過(guo)將LJ43和BJG進行雜交(jiao)得到F1代，綠(lv)(lv)(lv)(lv)色(se)(se)和黃色(se)(se)的(de)子代個(ge)體呈(cheng)1：1分離，表(biao)明葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)(lv)素(su)(su)(su)缺陷性狀受單基(ji)(ji)因(yin)控制。葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)(lv)素(su)(su)(su)a、葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)(lv)素(su)(su)(su)b和葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)(lv)素(su)(su)(su)總(zong)量在(zai)(zai)F1個(ge)體中存在(zai)(zai)差異，這(zhe)些性狀在(zai)(zai)不同年(nian)份間(jian)穩定(ding)，并且(qie)主要受潛在(zai)(zai)基(ji)(ji)因(yin)型的(de)影響。通過(guo)基(ji)(ji)因(yin)組測序(xu)的(de)遺傳(chuan)圖(tu)譜，在(zai)(zai)LG03染色(se)(se)體12.817–14.934 cM上(shang)鑒定(ding)了一個(ge)與總(zong)葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)(lv)素(su)(su)(su)含量相(xiang)關，穩定(ding)且(qie)具有顯著(zhu)效應的(de)QTL（qChls-3），解釋了在(zai)(zai)三年(nian)時(shi)間(jian)內觀察到的(de)表(biao)型變異的(de)69.7–74.8%。
圖1 茶樹葉片(pian)白化基因的鑒定(ding)
2.qChl-3的候選基因是鎂(mei)螯合酶I亞基
為了(le)進一(yi)步對(dui)主效QTL qChl-3進行定位(wei)(wei)，以‘白(bai)(bai)(bai)雞(ji)冠(guan)’為輪回父本構建了(le)BC1群體(ti)，三種(zhong)不(bu)同的(de)(de)(de)葉片(pian)(pian)表型：綠色、淡綠色和白(bai)(bai)(bai)化(hua)，分離比約為1:2:1，表明(ming)(ming)BJG的(de)(de)(de)葉片(pian)(pian)白(bai)(bai)(bai)化(hua)性(xing)狀由半顯性(xing)基(ji)因控(kong)制。采用(yong)BSA-seq和KASP分型相結合(he)的(de)(de)(de)策略，發現K37標記與qChl-3共(gong)分離，位(wei)(wei)于CsTGY08G0002006b。CsTGY08G0002006b編碼鎂螯合(he)酶I亞(ya)基(ji)（CsCHLI），該基(ji)因的(de)(de)(de)錯義突變（R400H）可能是導致(zhi)‘白(bai)(bai)(bai)雞(ji)冠(guan)’葉色白(bai)(bai)(bai)化(hua)的(de)(de)(de)原因。經UPLC-MS/MS分析，表明(ming)(ming)CsCHLI的(de)(de)(de)等(deng)位(wei)(wei)基(ji)因阻礙了(le)PPIX向Mg-PPIX的(de)(de)(de)轉(zhuan)化(hua)。
圖(tu)2 主效葉片白化(hua)性(xing)狀 qChl-3的精細定位
3.擬南芥異源轉化
將(jiang)含有(you)由花椰菜花葉(xie)病毒(du)（CaMV）35S啟動子驅動的(de)CsCHLIG和(he)(he)CsCHLIA等位基因的(de)構建(jian)，引入擬南芥葉(xie)片白化表(biao)(biao)型(xing)突變體（Atchli1），進行了(le)互補(bu)試驗。與(yu)Atchli1對照組相比，CsCHLIG過(guo)表(biao)(biao)達（OE）系表(biao)(biao)現(xian)出更綠(lv)、更大的(de)葉(xie)片，以及較早的(de)開(kai)花時間(jian)。OE-1和(he)(he)OE-2的(de)表(biao)(biao)達分別(bie)增加了(le)約300倍(bei)(bei)和(he)(he)500倍(bei)(bei)，導致OE-1和(he)(he)OE-2中(zhong)葉(xie)綠(lv)素含量(liang)(liang)也(ye)顯著高于Atchli1對照。這些發現(xian)表(biao)(biao)明，CsCHLIG通過(guo)葉(xie)綠(lv)素含量(liang)(liang)的(de)增加，恢(hui)復了(le)Atchli1的(de)葉(xie)片白化表(biao)(biao)型(xing)。
圖3 CsCHLIG 增(zeng)加擬南芥chli1突變(bian)體的葉綠素生物合成(cheng)
4.CsCHLI突變(bian)降低(di)ATP酶活(huo)性
與(yu)葉(xie)(xie)綠(lv)素積累模式一(yi)致，CsCHLI在(zai)(zai)葉(xie)(xie)片中(zhong)表(biao)(biao)達較高，在(zai)(zai)莖、根、花(hua)和果(guo)實中(zhong)表(biao)(biao)達較低(di)。亞(ya)細(xi)胞(bao)定(ding)位表(biao)(biao)明，CsCHLIG-GFP和CsCHLIA-GFP與(yu)葉(xie)(xie)綠(lv)體共同富(fu)集(ji)，而35S-GFP（對照）富(fu)集(ji)在(zai)(zai)細(xi)胞(bao)核和細(xi)胞(bao)質中(zhong)。這些發現表(biao)(biao)明，CsCHLI正向調控茶葉(xie)(xie)葉(xie)(xie)綠(lv)素含量，錯義突變不影(ying)響CsCHLI的亞(ya)細(xi)胞(bao)定(ding)位。
酵母雙(shuang)雜交和熒光素互補分析表明，CsCHLIG可以與(yu)CsCHLIG、CsCHLIA相(xiang)互作用，CsCHLIG、CsCHLIA都(dou)可以與(yu)CsCHLD結(jie)合。然而，體內CsCHLIA之(zhi)間(jian)的相(xiang)互作用消失(shi)了。GST pull-down結(jie)果(guo)表明，CsCHLI的突變只(zhi)影響(xiang)了兩個CsCHLIA亞基之(zhi)間(jian)的相(xiang)互作用，而不影響(xiang)CsCHLIA與(yu)CsCHLIG/CsCHLD之(zhi)間(jian)的相(xiang)互作用。
rCsCHLIA的(de)ATP酶(mei)活(huo)性(xing)僅(jin)為(wei)rCsCHLIG的(de)6.18%，而(er)對照組（僅(jin)有MBP）沒有活(huo)性(xing)。當rCsCHLIA以等摩爾比(bi)例(li)加入到含有rCsCHLIG的(de)反應(ying)混合物中時，rCsCHLIG的(de)ATP酶(mei)活(huo)性(xing)降(jiang)低(di)到兩(liang)個rCsCHLIG的(de)51.84%。然而(er)，兩(liang)個rCsCHLIA的(de)ATP酶(mei)活(huo)性(xing)僅(jin)為(wei)兩(liang)個rCsCHLIG的(de)3.95%。這(zhe)些結果(guo)表(biao)明，CsCHLIA的(de)ATP酶(mei)活(huo)性(xing)不足影響(xiang)了BJG的(de)葉綠素生物合成。
圖4 CsCHLI與(yu)CsCHLD的蛋(dan)白互作分析
5.CsCHLIA是氨基酸代(dai)謝的正調控(kong)因子
先(xian)前研究報道，茶樹的(de)(de)白(bai)化(hua)(hua)葉(xie)(xie)(xie)片(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸含(han)(han)(han)量(liang)(liang)比綠(lv)(lv)葉(xie)(xie)(xie)更高，但其潛在機制(zhi)仍未知。研究人員測量(liang)(liang)了BC1群體中(zhong)(zhong)(zhong)兩個純合基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)型（綠(lv)(lv)色(se)和(he)白(bai)化(hua)(hua)）的(de)(de)根和(he)葉(xie)(xie)(xie)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)22種氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸的(de)(de)含(han)(han)(han)量(liang)(liang)，發(fa)現：22種氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸在兩個基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)型的(de)(de)根中(zhong)(zhong)(zhong)沒有(you)(you)顯(xian)著差異；白(bai)化(hua)(hua)葉(xie)(xie)(xie)片(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)大多數(shu)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸的(de)(de)含(han)(han)(han)量(liang)(liang)比綠(lv)(lv)色(se)葉(xie)(xie)(xie)片(pian)高出10倍。白(bai)化(hua)(hua)葉(xie)(xie)(xie)片(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)沒有(you)(you)葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)(lv)體，只有(you)(you)白(bai)色(se)質(zhi)體；綠(lv)(lv)色(se)和(he)淡綠(lv)(lv)色(se)葉(xie)(xie)(xie)片(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)成熟和(he)完全發(fa)育的(de)(de)葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)(lv)體更豐富，且光(guang)系統II的(de)(de)最大量(liang)(liang)子產額（Fv/Fm）顯(xian)著高于白(bai)化(hua)(hua)葉(xie)(xie)(xie)片(pian)。通(tong)過RNA-seq，發(fa)現在綠(lv)(lv)葉(xie)(xie)(xie)和(he)白(bai)化(hua)(hua)葉(xie)(xie)(xie)片(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)，與氮(dan)和(he)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸代(dai)謝(xie)相關的(de)(de)DEGs沒有(you)(you)明顯(xian)的(de)(de)表達趨勢。這表明白(bai)化(hua)(hua)葉(xie)(xie)(xie)片(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸含(han)(han)(han)量(liang)(liang)的(de)(de)整體性增加，主(zhu)要與蛋白(bai)質(zhi)降解有(you)(you)關，而(er)不(bu)是激活氮(dan)和(he)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸的(de)(de)代(dai)謝(xie)。CsCHLIA等位基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)是通(tong)過促進(jin)蛋白(bai)質(zhi)降解，增加BJG中(zhong)(zhong)(zhong)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸含(han)(han)(han)量(liang)(liang)的(de)(de)正調控因(yin)(yin)子。
圖5 氨基(ji)酸含量及與氨基(ji)酸代(dai)謝相關的(de)DEGs的(de)分析
PART 4結(jie) 論
本研(yan)究先(xian)通過(guo)遺傳圖譜(pu)構建進(jin)行(xing)茶(cha)樹(shu)(shu)葉(xie)片白化(hua)(hua)性狀QTL的(de)(de)粗定(ding)位，后通過(guo)BSA和(he)KASP分型相結(jie)合(he)(he)的(de)(de)策(ce)略，精細定(ding)位到茶(cha)樹(shu)(shu)葉(xie)片白化(hua)(hua)性狀的(de)(de)候選基(ji)(ji)因CsTGY08G0002006b，編(bian)碼鎂(mei)螯合(he)(he)酶I亞基(ji)(ji)（CsCHLI）。結(jie)合(he)(he)擬南芥異源轉化(hua)(hua)、功能探究、RNA-seq等，證明(ming)了(le)CsCHLIG在(zai)維(wei)持正(zheng)常葉(xie)綠(lv)素生(sheng)物合(he)(he)成中的(de)(de)重要作(zuo)用，CsCHLIA介導的(de)(de)光損傷(shang)導致蛋白質降解(jie)，從而導致葉(xie)綠(lv)素缺(que)陷葉(xie)片中氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)含量增加。本研(yan)究加深了(le)對葉(xie)綠(lv)素和(he)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)代謝之間相互關系的(de)(de)理解(jie)，解(jie)析(xi)了(le)‘白雞冠(guan)’葉(xie)色白化(hua)(hua)的(de)(de)遺傳機制，并推動了(le)茶(cha)樹(shu)(shu)重要農藝性狀的(de)(de)遺傳分析(xi)。
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文章索引：Zhang C, Liu H, Wang J, et al. A key mutation in magnesium chelatase I subunit leads to a chlorophyll-deficient mutant of tea (Camellia sinensis)[J]. Journal of Experimental Botany, 2023: erad430.
