2,3-丁(ding)(ding)二(er)(er)醇(chun)(2,3-BD)是(shi)一(yi)種重要的(de)(de)化(hua)合(he)(he)(he)物，在(zai)可再(zai)(zai)生(sheng)能源領域、制藥(yao)行業和化(hua)學合(he)(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)領域有著廣泛的(de)(de)應用。大多(duo)(duo)(duo)數能夠產(chan)(chan)生(sheng)2,3-丁(ding)(ding)二(er)(er)醇(chun)的(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)種都有致病性，然(ran)而研(yan)究發現(xian)，多(duo)(duo)(duo)粘(zhan)類(lei)(lei)芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)（P. polymyxa）是(shi)一(yi)種安全(quan)的(de)(de)天然(ran)細菌(jun)(jun)(jun)，可以有效(xiao)地產(chan)(chan)生(sheng)純度≥98%的(de)(de)(R, R)-2,3-BD，因此，利(li)(li)用多(duo)(duo)(duo)粘(zhan)類(lei)(lei)芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)合(he)(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)2,3-丁(ding)(ding)二(er)(er)醇(chun)的(de)(de)研(yan)究越來越受到(dao)人們的(de)(de)關(guan)注。本研(yan)究利(li)(li)用轉(zhuan)錄組(zu)學和代謝(xie)組(zu)學相結合(he)(he)(he)的(de)(de)方法，鑒定了(le)多(duo)(duo)(duo)粘(zhan)類(lei)(lei)芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)中葡萄糖衍(yan)生(sheng)的(de)(de)2,3-丁(ding)(ding)二(er)(er)醇(chun)途(tu)徑及其(qi)相關(guan)基因，并通過(guo)直接敲除或(huo)過(guo)表達以提高2,3-丁(ding)(ding)二(er)(er)醇(chun)的(de)(de)產(chan)(chan)量。最后(hou)，在(zai)添(tian)加spo0A的(de)(de)情況下，對多(duo)(duo)(duo)黏類(lei)(lei)芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)SC2-M1進行了(le)利(li)(li)用楊(yang)樹原水解液(ye)生(sheng)產(chan)(chan)2,3-BD的(de)(de)試驗(yan)，為(wei)多(duo)(duo)(duo)粘(zhan)類(lei)(lei)芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)低成(cheng)(cheng)(cheng)本工(gong)業化(hua)生(sheng)產(chan)(chan)2,3-BD奠定了(le)基礎,同時(shi)也為(wei)利(li)(li)用楊(yang)木原料(liao)(liao)水解物生(sheng)產(chan)(chan)可再(zai)(zai)生(sheng)燃料(liao)(liao)提供了(le)一(yi)種新(xin)方案。

1.轉錄組和代謝(xie)組聯合分析揭示了P. Polymyxa SC2菌株生產2,3-丁二醇的合成和調控基因

將P.polymyxa SC2細胞在含(han)0%葡萄糖(tang)(CK)和(he)2%葡萄糖(tang)(SC)的(de)LB培養(yang)基中培養(yang)。選擇培養(yang)6小時的(de)細胞懸浮(fu)液進行轉錄組(zu)和(he)代(dai)(dai)(dai)謝組(zu)分析(xi)。對(dui)轉錄組(zu)和(he)代(dai)(dai)(dai)謝組(zu)數據進行KEGG富(fu)集分析(xi)發現，添加2%葡萄糖(tang)后(hou)對(dui)碳(tan)水(shui)化合(he)物(wu)和(he)能量代(dai)(dai)(dai)謝等(deng)通路(lu)有(you)顯著(zhu)影響，同時發現，P. polymyxa SC2在葡萄糖(tang)代(dai)(dai)(dai)謝、2,3-BD和(he)副產物(wu)合(he)成方面的(de)基因發生(sheng)了(le)差異顯著(zhu)(圖1)。值得注意的(de)是，在丙酮酸生(sheng)成2,3-BD的(de)代(dai)(dai)(dai)謝途徑中，編碼乙(yi)酰(xian)乳酸合(he)成酶(alsS)和(he)乙(yi)酰(xian)乳酸脫(tuo)(tuo)羧酶(alsD)的(de)基因轉錄水(shui)平顯著(zhu)上調，而編碼丁二醇(chun)(chun)脫(tuo)(tuo)氫酶(bdh)的(de)基因轉錄水(shui)平顯著(zhu)下(xia)調。qPCR驗證后(hou)同樣發現bdh下(xia)調。分析(xi)發現，2,3-BD的(de)合(he)成過(guo)程中，有(you)許多副產物(wu)如(ru)乳酸以及(ji)乙(yi)酸的(de)產生(sheng)與限制了(le)編碼丁二醇(chun)(chun)脫(tuo)(tuo)氫酶(bdh)的(de)基因的(de)表達，導致2,3-BD的(de)產生(sheng)受到限制。

圖1糖(tang)酵解途徑、戊糖(tang)磷酸途徑、三羧酸循(xun)環、2,3-BD合成途徑及(ji)部(bu)分(fen)副產物的轉錄(lu)調控分(fen)析(xi)

2.敲除(chu)乳酸脫氫酶基因能增加(jia)2,3-丁二醇的合(he)成

在以葡萄糖為(wei)主要碳源培(pei)養P. polymyxa SC2的(de)(de)過程中(zhong)，除了2,3-BD外，還產(chan)(chan)(chan)(chan)生了副(fu)產(chan)(chan)(chan)(chan)物。乳酸(suan)(suan)(suan)(suan)是(shi)一個(ge)重要的(de)(de)副(fu)產(chan)(chan)(chan)(chan)物，代謝組結果顯(xian)示(shi)其增加(jia)了1.3倍(圖(tu)1)。在P. polymyxa SC2中(zhong)鑒定了兩(liang)個(ge)乳酸(suan)(suan)(suan)(suan)脫氫酶基因(yin)(yin)ldh1和(he)(he)ldh3。為(wei)了研(yan)究這兩(liang)個(ge)基因(yin)(yin)與乳酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)2,3-BD產(chan)(chan)(chan)(chan)生的(de)(de)關系，本(ben)研(yan)究對(dui)這兩(liang)個(ge)基因(yin)(yin)進(jin)行了敲(qiao)除實驗。結果發現，僅敲(qiao)除ldh3可顯(xian)著降低(di)乳酸(suan)(suan)(suan)(suan)合成，增加(jia)2,3- BD產(chan)(chan)(chan)(chan)量。然(ran)而(er)，ldh1的(de)(de)單(dan)一缺(que)失(shi)并不影(ying)響乳酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)合成，而(er)是(shi)促進(jin)了2,3-BD的(de)(de)產(chan)(chan)(chan)(chan)生，會略微上(shang)調ldh3和(he)(he)2,3-BD合成基因(yin)(yin)alsS、alsD和(he)(he)bdh的(de)(de)表達水平(圖(tu)2A),ldh1和(he)(he)ldh3共缺(que)失(shi)菌(jun)株的(de)(de)2,3-BD產(chan)(chan)(chan)(chan)量略低(di)于單(dan)缺(que)失(shi)菌(jun)株，但產(chan)(chan)(chan)(chan)量較高比原菌(jun)株SC2-M1高出(chu)21%。此外，乙酰膽堿、乳酸(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)和(he)(he)乙醇(chun)含量顯(xian)著降低(di)(圖(tu)2B)。

3.基因(yin)bdh的(de)過表達進一步促進2,3-丁二(er)醇的(de)合(he)成

轉(zhuan)錄(lu)組結果表明，bdh的下調可能是限制2,3-BD產生(sheng)的因(yin)素之一，為了進一步提高2,3-BD的合成，我們在P. polymyxa M1-L31中過表達(da)bdh基(ji)因(yin)。得到的菌(jun)株(zhu)P. polymyxa M1-L31- Pb在相(xiang)對需(xu)氧和(he)弱(ruo)酸性(xing)培養條件下生(sheng)長良好(圖(tu)3A)。2,3-BD和(he)乙(yi)醇合成初期使(shi)用葡(pu)萄糖(tang)作為營養物質(zhi)(圖(tu)3B-C),隨著介(jie)質(zhi)中的營養物質(zhi)的消(xiao)耗,菌(jun)株(zhu)往(wang)往(wang)將2,3-BD乙(yi)偶聯,從而形(xing)成NADH維持(chi)其(qi)生(sheng)理活動(圖(tu)3C)。過表達(da)bdh菌(jun)株(zhu)M1-L31- Pb的2,3-BD產量(liang)比菌(jun)株(zhu)SC2-M1提高了22%，達(da)到最大理論值的87%(圖(tu)3D)。

圖3 多黏芽孢桿菌M1-L31、M1-L31- Pb和SC2-M1在相對好氧和弱酸性培養條件下對葡萄糖的代謝能力

4.孢子形(xing)成基因(yin)spo0A和spoIIE對多粘芽孢桿菌細胞形(xing)態、代(dai)謝能力和2,3-丁二醇合成的影(ying)響

有研究表明，多(duo)粘類(lei)芽孢(bao)桿菌(jun)(jun)(jun)孢(bao)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)形(xing)成通常會(hui)影(ying)響(xiang)底物的(de)(de)(de)利(li)(li)用(yong)效(xiao)率，延長(chang)(chang)(chang)發(fa)酵過程(cheng)，在(zai)(zai)P. polymyxa中(zhong)，敲(qiao)除(chu)spo0A基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)以(yi)(yi)丟失(shi)孢(bao)子(zi)(zi)會(hui)顯著(zhu)降低2,3-BD的(de)(de)(de)合成。為了探究孢(bao)子(zi)(zi)形(xing)成對多(duo)粘類(lei)芽孢(bao)桿菌(jun)(jun)(jun)合成2,3-BD的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)進行了以(yi)(yi)下研究。我們在(zai)(zai)葡(pu)萄(tao)糖(tang)以(yi)(yi)及充足氧(yang)氣(qi)的(de)(de)(de)培(pei)養(yang)條件下發(fa)現(xian)(xian)，SC2（野生(sheng)型(xing)）、SC2-M1（自然突變(bian)型(xing)）、M1-SP（spo0A基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)恢(hui)復(fu)型(xing)）、M1- SPE（M1-SP菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)敲(qiao)除(chu)spoIIE基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)）和(he)M1- SE (菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)SC2-M1中(zhong)spoIIE基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)單(dan)缺(que)失(shi))5株(zhu)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)在(zai)(zai)培(pei)養(yang)初期(qi)(qi)表現(xian)(xian)出相(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)生(sheng)長(chang)(chang)(chang)趨勢(圖(tu)4A)。結果發(fa)現(xian)(xian)，在(zai)(zai)培(pei)養(yang)初期(qi)(qi)恢(hui)復(fu)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)M1-SP和(he)M1- SPE的(de)(de)(de)spo0A基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，可大(da)大(da)提(ti)高菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)SC2的(de)(de)(de)葡(pu)萄(tao)糖(tang)消耗(hao)量(liang)(liang)(liang)(圖(tu)4B-D)。培(pei)養(yang)12 h后，SC2和(he)M1-SP的(de)(de)(de)葡(pu)萄(tao)糖(tang)消耗(hao)量(liang)(liang)(liang)顯著(zhu)高于菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)SC2-M1，菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)M1- SPE的(de)(de)(de)葡(pu)萄(tao)糖(tang)消耗(hao)量(liang)(liang)(liang)顯著(zhu)高于菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)M1-SE。結合轉(zhuan)錄(lu)組學數據推測(ce),恢(hui)復(fu)spo0A可以(yi)(yi)增強葡(pu)萄(tao)糖(tang)的(de)(de)(de)跨(kua)膜轉(zhuan)運(yun)，從(cong)而增加2,3-BD的(de)(de)(de)產生(sheng)(圖(tu)4B)。與菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)SC2-M1相(xiang)比，與葡(pu)萄(tao)糖(tang)轉(zhuan)運(yun)相(xiang)關的(de)(de)(de)亞基(ji)(ji)(ji)(ji)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在(zai)(zai)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)M1-SP中(zhong)顯著(zhu)上調(diao)(圖(tu)4E)。結果表明，spo0A基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)恢(hui)復(fu)改(gai)善了葡(pu)萄(tao)糖(tang)的(de)(de)(de)跨(kua)膜轉(zhuan)運(yun)，提(ti)高了細胞(bao)內葡(pu)萄(tao)糖(tang)含量(liang)(liang)(liang)，從(cong)而提(ti)高了2,3- BD的(de)(de)(de)產量(liang)(liang)(liang)。雖然spoIIE的(de)(de)(de)缺(que)失(shi)使菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)M1-SPE在(zai)(zai)培(pei)養(yang)中(zhong)后期(qi)(qi)促進了微(wei)(wei)生(sheng)物的(de)(de)(de)生(sheng)長(chang)(chang)(chang)，但與菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)M1-SP相(xiang)比，它不利(li)(li)于2,3-BD的(de)(de)(de)合成。

5．不同碳源(yuan)和條件下(xia)工程多粘(zhan)菌合成(cheng)2,3-丁二(er)醇(chun)的特性

培養(yang)基(ji)中(zhong)氧(yang)(yang)的(de)(de)(de)濃(nong)度(du)對菌(jun)株的(de)(de)(de)生(sheng)長(chang)和(he)發(fa)酵(jiao)產物(wu)的(de)(de)(de)合成(cheng)有顯著(zhu)影響。有研究表(biao)明(ming)(ming)，嚴格的(de)(de)(de)好(hao)氧(yang)(yang)或厭氧(yang)(yang)條件(jian)不利于(yu)2,3- BD的(de)(de)(de)合成(cheng)。在(zai)(zai)(zai)好(hao)氧(yang)(yang)條件(jian)下(xia)，M1-L31-Pb和(he)M1-L31-PbS在(zai)(zai)(zai)培養(yang)約27 h后(hou)均(jun)達(da)到2,3-BD的(de)(de)(de)最大產量(liang)(圖5D)。在(zai)(zai)(zai)限(xian)氧(yang)(yang)條件(jian)下(xia)，菌(jun)株的(de)(de)(de)生(sheng)長(chang)有所(suo)下(xia)降(jiang)(圖5A),而2,3-BD的(de)(de)(de)合成(cheng)趨(qu)于(yu)穩定(ding)，2,3-BD的(de)(de)(de)還原量(liang)明(ming)(ming)顯減少(圖5D),乙醇和(he)乳(ru)酸(suan)的(de)(de)(de)合成(cheng)增加，但乳(ru)酸(suan)含量(liang)仍然很低(di)(di)(圖5F- G)。綜上所(suo)述，在(zai)(zai)(zai)好(hao)氧(yang)(yang)培養(yang)條件(jian)下(xia)，P. polymyxa生(sheng)長(chang)較(jiao)好(hao)，2,3-BD產量(liang)較(jiao)高，但2,3-BD在(zai)(zai)(zai)后(hou)期容易被菌(jun)株分解且副產物(wu)濃(nong)度(du)顯著(zhu)升高，不利于(yu)培養(yang)后(hou)期2,3-BD的(de)(de)(de)分離純化。雖然在(zai)(zai)(zai)限(xian)氧(yang)(yang)條件(jian)下(xia)，菌(jun)株的(de)(de)(de)生(sheng)長(chang)速度(du)下(xia)降(jiang)，但相同數量(liang)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)表(biao)現出良好(hao)的(de)(de)(de)發(fa)酵(jiao)性能，并且2,3-BD在(zai)(zai)(zai)發(fa)酵(jiao)后(hou)期不易分解，副產物(wu)濃(nong)度(du)低(di)(di)。

本(ben)(ben)研究以楊樹的(de)(de)(de)水(shui)解(jie)(jie)(jie)液為(wei)發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)底物，對工程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)M1-L31-Pb和(he)M1-L31-PbS在(zai)培養基的(de)(de)(de)高(gao)密度發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)性(xing)能(neng)進行了評價。這兩(liang)種菌(jun)(jun)株(zhu)在(zai)楊樹的(de)(de)(de)原始(shi)水(shui)解(jie)(jie)(jie)液中(zhong)(zhong)生(sheng)長(chang)良好，其發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)性(xing)能(neng)受不同發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)條件的(de)(de)(de)影響較大(da)。與菌(jun)(jun)株(zhu)M1-L31-Pb相比， M1-L31-PbS對葡萄糖和(he)木(mu)糖的(de)(de)(de)利用(yong)(yong)效率(lv)和(he)2,3-BD的(de)(de)(de)合成(cheng)(cheng)效率(lv)更(geng)高(gao)，但(dan)2,3-BD的(de)(de)(de)產(chan)量(liang)(liang)較低(di)。然而，菌(jun)(jun)株(zhu)M1-L31-PbS使(shi)更(geng)多(duo)的(de)(de)(de)碳(tan)源用(yong)(yong)于(yu)乙醇合成(cheng)(cheng)(圖6B)。同時，葡萄糖和(he)木(mu)糖也提高(gao)了菌(jun)(jun)株(zhu)M1-L31-PbS的(de)(de)(de)乙醇合成(cheng)(cheng)能(neng)力。使(shi)用(yong)(yong)楊木(mu)水(shui)解(jie)(jie)(jie)液的(de)(de)(de)兩(liang)種工程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)的(de)(de)(de)2,3-BD產(chan)量(liang)(liang)普遍(bian)高(gao)于(yu)使(shi)用(yong)(yong)純葡萄糖和(he)木(mu)糖的(de)(de)(de)菌(jun)(jun)株(zhu)，本(ben)(ben)研究中(zhong)(zhong)使(shi)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)工程(cheng)菌(jun)(jun)株(zhu)能(neng)產(chan)生(sheng)纖維素酶，并(bing)繼續分(fen)解(jie)(jie)(jie)楊木(mu)原水(shui)解(jie)(jie)(jie)液中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)大(da)分(fen)子(zi)(zi)纖維素，以產(chan)生(sheng)額外的(de)(de)(de)碳(tan)源，如葡萄糖，最(zui)終達(da)到更(geng)高(gao)的(de)(de)(de)2,3-BD產(chan)量(liang)(liang)。本(ben)(ben)研究中(zhong)(zhong)，在(zai)缺孢(bao)(bao)菌(jun)(jun)株(zhu)SC2-M1中(zhong)(zhong)添加(jia)Spo0A顯著提高(gao)了楊樹水(shui)解(jie)(jie)(jie)液中(zhong)(zhong)碳(tan)的(de)(de)(de)利用(yong)(yong)效率(lv)，減少了長(chang)期發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)造成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)碳(tan)損(sun)失，并(bing)阻(zu)止了野生(sheng)型菌(jun)(jun)株(zhu)SC2因孢(bao)(bao)子(zi)(zi)形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)而導致(zhi)的(de)(de)(de)2,3-BD的(de)(de)(de)分(fen)解(jie)(jie)(jie)。適度的(de)(de)(de)孢(bao)(bao)子(zi)(zi)形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)有利于(yu)2,3-BD的(de)(de)(de)合成(cheng)(cheng)。菌(jun)(jun)株(zhu)M1-L31-PbS利用(yong)(yong)楊木(mu)原水(shui)解(jie)(jie)(jie)液，2,3-BD的(de)(de)(de)最(zui)大(da)產(chan)量(liang)(liang)達(da)到理論最(zui)大(da)值的(de)(de)(de)93%。

本(ben)研究通(tong)過對多(duo)粘類芽(ya)孢桿(gan)菌轉錄組和(he)代(dai)謝組的聯合分析，揭(jie)示了2,3-BD的合成途(tu)徑和(he)一些限制因(yin)素。通(tong)過對多(duo)粘類芽(ya)孢桿(gan)菌基(ji)因(yin)組中的ldh1、ldh3、bdh、spo0A和(he)spoIIE進行基(ji)因(yin)修(xiu)飾(shi)，提(ti)高(gao)了2,3-BD的產(chan)量(liang)(liang)。該工程菌株(zhu)通(tong)過發(fa)酵楊樹原水解液，2,3-BD產(chan)量(liang)(liang)最高(gao)可達0.465 g/g。2,3-丁二(er)醇(chun)和(he)乙醇(chun)的總得率為(wei)21.7 g/L。本(ben)研究為(wei)多(duo)粘類芽(ya)孢桿(gan)菌發(fa)酵生產(chan)2,3-丁二(er)醇(chun)和(he)乙醇(chun)提(ti)供(gong)了一種新的改進方(fang)法。