2024-01-30
近日，江蘇大學附(fu)屬人(ren)(ren)民(min)醫(yi)院(yuan)在《Human Genomics》發(fa)表新(xin)研(yan)究(jiu)(jiu)成果！本文研(yan)究(jiu)(jiu)從發(fa)炎的(de)眼(yan)部分(fen)離出的(de)菌株巴(ba)西副塵孢菌P. brasiliense GGX 413，組(zu)(zu)裝出GGX 413的(de)基因(yin)組(zu)(zu)，并從遺傳學角度研(yan)究(jiu)(jiu)了(le)GGX 413的(de)毒(du)力因(yin)子、CAZymes、肽酶、次級(ji)代謝產(chan)物和其(qi)他(ta)基因(yin)產(chan)物，篩選(xuan)其(qi)基因(yin)組(zu)(zu)中(zhong)與人(ren)(ren)類(lei)疾(ji)病(bing)相(xiang)關的(de)致病(bing)基因(yin)，有助(zhu)于未來研(yan)究(jiu)(jiu)GGX 413和其(qi)他(ta)真菌在人(ren)(ren)類(lei)中(zhong)的(de)潛在致病(bing)機制。
本研究的測序(xu)和分析由(you)上海派(pai)森諾生物科技股份有限公(gong)司完成。
01、研究背(bei)景 Paraconiothyrium屬(shu)包括(kuo)27個種(zhong)，該屬(shu)通(tong)常被描(miao)述為含有(you)植物(wu)病(bing)原(yuan)體和人類(lei)機會性病(bing)原(yuan)體。2004年巴西的(de)(de)(de)M.Taniwaki首次從阿拉伯咖啡果實中分(fen)離(li)出(chu)(chu)P.brasilianse，并由(you)Verkley等人首次描(miao)述。像(xiang)其他Paraconiothyrium屬(shu)物(wu)種(zhong)一(yi)(yi)樣(yang)，P.brasilianse具有(you)多種(zhong)生(sheng)物(wu)活(huo)(huo)性，在(zai)許多領域中具有(you)潛在(zai)的(de)(de)(de)應用前景。例(li)如，從喜(xi)馬拉雅紫(zi)杉中分(fen)離(li)出(chu)(chu)的(de)(de)(de)P.brasilianse產生(sheng)具有(you)抗腫瘤活(huo)(huo)性的(de)(de)(de)紫(zi)杉醇。Arredondo Santoyo等人指出(chu)(chu)從元寶楓中分(fen)離(li)得到的(de)(de)(de)四種(zhong)三環(huan)倍半萜對人免疫缺陷病(bing)毒1（HIV-1）表現出(chu)(chu)有(you)效的(de)(de)(de)活(huo)(huo)性。Afshan第一(yi)(yi)個報(bao)道(dao)P.brasiliense在(zai)巴基斯(si)坦引(yin)(yin)起(qi)柳(liu)葉野扇(shan)花葉斑病(bing)，但(dan)目前還(huan)沒有(you)關于P.brasilianse在(zai)人類(lei)中引(yin)(yin)起(qi)疾病(bing)的(de)(de)(de)報(bao)道(dao)。 在這項研究中，在一名(ming)左眼瞼樹枝損(sun)傷的(de)患者中分離出一種致(zhi)病(bing)(bing)性(xing)P.brasilianse菌株，該菌株會(hui)導致(zhi)蜂窩(wo)組織炎。為(wei)研究其發病(bing)(bing)機制，從蛋白(bai)質組學(xue)和病(bing)(bing)原菌的(de)轉錄組學(xue)進(jin)行(xing)了研究，采用(yong)二代測(ce)序(xu)(xu)(xu)和三(san)代測(ce)序(xu)(xu)(xu)技術對其全(quan)基因(yin)組進(jin)行(xing)了測(ce)序(xu)(xu)(xu)。基于全(quan)基因(yin)組序(xu)(xu)(xu)列進(jin)行(xing)了生物信息(xi)學(xue)分析，包括(kuo)蛋白(bai)質編(bian)碼(ma)基因(yin)的(de)功能注釋(shi)、分類鑒定、致(zhi)病(bing)(bing)因(yin)子的(de)預測(ce)以(yi)及重復(fu)序(xu)(xu)(xu)列和非編(bian)碼(ma)RNA（ncRNA）的(de)分析。
02、研究材料(liao)與方(fang)法 1.實驗(yan)材料： P. brasiliense GGX 41, 是一種(zhong)火焰狀真菌。 2.測序平臺(tai) Illumina NavoSeq（二代(dai)）+Nanopore（三代(dai)） 3.分(fen)析內容(rong) 基因組組裝+注釋、ITS進化樹、基因家族分析、單拷貝進化樹、特有基因功能分析等(deng)。
03、研究結果 分(fen)離菌(jun)株(zhu)的形(xing)態與鑒定 患(huan)者(zhe)被診斷為(wei)左(zuo)眼瞼蜂(feng)窩組織炎(yan)，由(you)一種(zhong)火(huo)焰(yan)(yan)狀真菌(jun)引起，其菌(jun)絲體呈隔(ge)膜狀（圖(tu)1A和B）。SDA培(pei)養基上(shang)的(de)真菌(jun)菌(jun)落(luo)是(shi)圓(yuan)形(xing)的(de)，邊緣整齊，凸起度(du)低(di)，菌(jun)落(luo)表面均勻到(dao)略呈褐(he)色，被氈質焦斑(ban)覆蓋。菌(jun)落(luo)邊緣白(bai)色，從邊緣到(dao)中心(xin)變暗(an)，氣生菌(jun)絲由(you)白(bai)色變為(wei)深褐(he)色。菌(jun)落(luo)的(de)直徑在4天后為(wei)16毫米(mi)（圖(tu)1C），在8天后為(wei)42毫米(mi)（圖(tu)1D），在12天后為(wei)60毫米(mi)（圖(tu)1E）。根據感(gan)染患(huan)者(zhe)的(de)信息(xi)，將火(huo)焰(yan)(yan)狀真菌(jun)命名為(wei)GGX 413。 圖1 火焰狀真菌的形態學 GGX 413基因(yin)組組裝(zhuang)和特征分(fen)析 通過二代+三代測序數(shu)據組(zu)(zu)裝GGX 413基(ji)因組(zu)(zu)，共獲得(de)11個(ge)(ge)scaffolds，39.49Mb的(de)基(ji)因組(zu)(zu)序列(lie)，GC含量為51.2%。最小和(he)最大(da)序列(lie)長(chang)度(du)(du)分別(bie)(bie)為0.24Mb和(he)5.24Mb，N50為4.62Mb。包含13,057個(ge)(ge)蛋白編碼基(ji)因，總(zong)長(chang)度(du)(du)20.17Mb（占比(bi)51.1%）。共預測了181個(ge)(ge)ncRNA，ncRNA的(de)平(ping)均長(chang)度(du)(du)和(he)總(zong)長(chang)度(du)(du)分別(bie)(bie)為514.2bp和(he)93073bp，占全基(ji)因組(zu)(zu)的(de)0.24%。基(ji)因組(zu)(zu)的(de)詳細特征如圈圖所示（圖2）。 圖2 P. brasiliense GGX 413基因組圈圖和(he)詳情統計(ji)表 GGX 413物(wu)種進(jin)化關系 基(ji)于GGX 413的(de)552bp的(de)ITS序列，在GenBank數據庫進(jin)行(xing)(xing)序列比(bi)對，使(shi)用(yong)與(yu)GGX 413相似(si)性(xing)>90%的(de)代表性(xing)序列進(jin)行(xing)(xing)系(xi)統發育(yu)分析，并使(shi)用(yong)蠕(ru)蟲孢(bao)菌（AF145704）和(he)茄(qie)長(chang)蠕(ru)孢(bao)（AF163089）的(de)ITS序列作為外群（圖3）：GGX 413屬于巴西副(fu)錐藻群，bootstrap值為93%，表明進(jin)化(hua)關系(xi)是可靠的(de)。還基(ji)于10個物種的(de)4995個單拷(kao)貝基(ji)因(yin)家族生(sheng)成(cheng)系(xi)統發育(yu)樹(shu)，以確定它(ta)們與(yu)GGX 413的(de)基(ji)因(yin)組相似(si)性(xing)（圖4），GGX 413與(yu)從杏樹(shu)中(zhong)分離出的(de)P.brasiliense M42-189和(he)從中(zhong)國(guo)白蠟介殼蟲中(zhong)分離出來的(de)Paraconiothyrium sp.Pb-2020密切相關。 圖3 23個(ge)真菌ITS進化樹(shu) 圖4 10個真菌單(dan)拷貝基因進化樹 致病性相關基因(yin)的預(yu)測 PHI數據庫共注釋出2,905個（22.2%）基(ji)因(yin)(yin)，分(fen)(fen)為八組（圖(tu)5），共有(you)1,579個基(ji)因(yin)(yin)與毒力有(you)關(guan)。DFVF數據庫注釋毒力因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)相關(guan)基(ji)因(yin)(yin)，共1,186個（9.08%）基(ji)因(yin)(yin)與疾(ji)病(bing)相關(guan)（圖(tu)6A和B）。篩(shai)選可能(neng)(neng)導致人類疾(ji)病(bing)的(de)高(gao)(gao)毒力或致命毒力因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)的(de)基(ji)因(yin)(yin)（圖(tu)6C），592個參與人類疾(ji)病(bing)的(de)基(ji)因(yin)(yin)中(zhong)(zhong)有(you)61個編碼(ma)(ma)致死毒力因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)，其中(zhong)(zhong)30個編碼(ma)(ma)高(gao)(gao)通氣因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)。分(fen)(fen)析編碼(ma)(ma)與人類疾(ji)病(bing)相關(guan)的(de)毒力因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)（DFVF-HUM）的(de)基(ji)因(yin)(yin)的(de)GO功能(neng)(neng)注釋（圖(tu)6D）：525個基(ji)因(yin)(yin)參與“分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)功能(neng)(neng)”，其次是(shi)“生物過程”（483）和“細(xi)胞成分(fen)(fen)”（370）。這些基(ji)因(yin)(yin)主要分(fen)(fen)布在“發病(bing)機制”（311）、“ATP結合(he)”（153）和“菌(jun)絲(si)生長”（129）中(zhong)(zhong)。 圖5 菌GGX 413基(ji)因組中(zhong)基(ji)因的PHI注釋功能分類統計 圖6 菌(jun)GGX 413基因組(zu)中(zhong)編(bian)碼DFVF-HUM的基因分析 GGX 413基因(yin)組中編(bian)碼蛋白基因(yin)的KOG和KEGG功(gong)能注釋 KOG共(gong)注釋出11,000個(ge)基因，占GGX 413基因組ORF的(de)(de)(de)84.2%（圖7）。結(jie)合(he)人類疾病的(de)(de)(de)毒力因子數據，27個(ge)編碼DFVF-HUM的(de)(de)(de)基因參(can)與了次級代謝產物(wu)的(de)(de)(de)合(he)成。 KEGG共(gong)注釋出4,104個(ge)(ge)基因，占ORF總數(shu)(shu)的31.4%，參與462個(ge)(ge)KEGG途徑(jing)（圖8）。結合(he)人類疾(ji)病的毒力(li)因子數(shu)(shu)據(ju)進行了進一步的分析，結果表明編碼DFVF-HUM的四個(ge)(ge)基因參與了萜類代謝(xie)。這四個(ge)(ge)基因中有兩(liang)個(ge)(ge)編碼的蛋白(bai)質是乙酰輔酶(mei)A C-乙酰轉移酶(mei)，另外兩(liang)個(ge)(ge)基因編碼甲羥戊(wu)酸激酶(mei)和角鯊烯單加氧酶(mei)。 圖7 菌GGX 413基因組(zu)中基因的KOG注釋分析 圖8 菌GGX 413基(ji)因組(zu)中基(ji)因的(de)KEGG注釋分析 與人類疾病相(xiang)關的分泌(mi)(mi)組(zu)和分泌(mi)(mi)肽酶的測定 分泌(mi)(mi)蛋(dan)白(bai)預(yu)(yu)測(ce)出841個分泌(mi)(mi)蛋(dan)白(bai)，其(qi)中278個基(ji)(ji)因(yin)(yin)編碼92種(zhong)與人(ren)類(lei)疾(ji)(ji)病(bing)有(you)(you)關(guan)。MEROPS數據(ju)庫預(yu)(yu)測(ce)有(you)(you)1,853個基(ji)(ji)因(yin)(yin)參(can)與肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶合成。比較(jiao)分泌(mi)(mi)組、肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶和(he)DFVF-HUM的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)序(xu)列，篩選與人(ren)類(lei)致病(bing)性(xing)相關(guan)的(de)分泌(mi)(mi)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶（圖9A）。肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶和(he)DFVF-HUM之間共有(you)(you)119個基(ji)(ji)因(yin)(yin)，分泌(mi)(mi)組、肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶和(he)DFVF-HUM中共有(you)(you)70個基(ji)(ji)因(yin)(yin)，這表明119個基(ji)(ji)因(yin)(yin)編碼的(de)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶參(can)與人(ren)類(lei)疾(ji)(ji)病(bing)，其(qi)中70個是(shi)分泌(mi)(mi)的(de)。這些肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶根據(ju)其(qi)催化類(lei)型分為五類(lei)（圖9B），最豐富的(de)絲氨酸肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶和(he)金屬肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶分別是(shi)枯草(cao)桿(gan)菌蛋(dan)白(bai)酶亞家族（8A）和(he)氨基(ji)(ji)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶Y（M28）家族（圖9C）。 圖9 菌GGX 413基因組中與人類疾病(bing)相關的(de)分泌肽酶編碼基因分析 CAZymes數據庫注(zhu)釋分析 共注釋出826個(ge)編碼(ma)(ma)(ma)CAZymes的基(ji)(ji)因和(he)15個(ge)編碼(ma)(ma)(ma)碳(tan)水(shui)化合(he)物(wu)(wu)結合(he)模塊（CBM）的基(ji)(ji)因，占比6.44%。通過(guo)比較分泌組、CAZymes和(he)DFVF-HUM的基(ji)(ji)因序列，Venn圖(tu)顯示(shi)，54個(ge)基(ji)(ji)因在CAZymes和(he)DFVF-HUM間(jian)共有(you)，46個(ge)基(ji)(ji)因在分泌組、CAZyme和(he)DFVF-HUM間(jian)共有(you)。這表(biao)明由54個(ge)基(ji)(ji)因編碼(ma)(ma)(ma)的CAZyms對(dui)人類疾病有(you)貢獻，其(qi)中46個(ge)具有(you)分泌特性(xing)（圖(tu)10A），和(he)CE家族（圖(tu)10B），GO功能分析表(biao)明，這些(xie)CAZymes在轉移己糖(tang)基(ji)(ji)和(he)糖(tang)基(ji)(ji)、水(shui)解O-糖(tang)基(ji)(ji)化合(he)物(wu)(wu)和(he)離(li)子結合(he)方面發(fa)揮著至關重要的作用(yong)（圖(tu)10C）。 圖10 菌GGX 413基因組中(zhong)與(yu)人(ren)類疾病相(xiang)關的分泌型CAZymes基因的分析 GGX413特有基因家(jia)族(zu)分析 通過對7個(ge)親緣關(guan)系密切(qie)的(de)(de)(de)菌株的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)家(jia)族(zu)的(de)(de)(de)分(fen)析，鑒定了(le)GGX 413的(de)(de)(de)特有基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)（圖(tu)11），并(bing)對其(qi)GO功(gong)能(neng)進行(xing)了(le)富(fu)集分(fen)析。GGX 413特有的(de)(de)(de)355個(ge)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)家(jia)族(zu)，共包含(han)357個(ge)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)。GO富(fu)集分(fen)析表明，GGX 413的(de)(de)(de)特有基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)主要與(yu)RNA生物合成和(he)代謝過程的(de)(de)(de)調控有關(guan)。還分(fen)析了(le)GGX 413毒力因(yin)(yin)(yin)子(zi)的(de)(de)(de)特異性。并(bing)與(yu)巴西假單胞菌M42-189和(he)副錐藻的(de)(de)(de)毒力因(yin)(yin)(yin)子(zi)進行(xing)了(le)比較。在Pb-2020中(zhong)，檢(jian)測(ce)到五種(zhong)特定毒力因(yin)(yin)(yin)子(zi)，其(qi)中(zhong)三種(zhong)（Q59RW3-CANAL、CARP3-CANAL和(he)A6ZLA2_ YEAS7）與(yu)人類傳染病有關(guan)（圖(tu)12）。 圖11 基(ji)因家族聚類(lei)分(fen)析 圖(tu)12菌GGX 413特(te)有(you)毒力因子(zi)分析
04、研究結(jie)論 1.利用(yong)全(quan)基因組測序技術對GGX 413的基因組進行組裝(zhuang)注釋，為研究其(qi)基因組的結構(gou)特征和功能提供(gong)了基礎。 2.從(cong)遺(yi)傳學(xue)角度研究(jiu)了(le)GGX 413的(de)毒力因(yin)子(zi)、CAZymes、肽酶、次級代謝產(chan)物和其他(ta)(ta)基因(yin)產(chan)物，并(bing)篩(shai)選了(le)其基因(yin)組中與人(ren)類(lei)疾病相關的(de)致(zhi)病基因(yin)，有助于未來研究(jiu)GGX 413和其他(ta)(ta)真菌在人(ren)類(lei)中的(de)潛在致(zhi)病機制。
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文章索(suo)引(yin)：Liu, H.B.,Zhang, Y., Chen, J.Gl. (2023).Whole-genome sequencing and functional annotation of pathogenic Paraconiothyrium brasiliense causing human cellulitis[J].Human Genomics. doi.org/10.1186/s40246-023-00512-5.
