2024-01-31
文章題目：Streptomyces-based whole-cell biosensors for detecting diverse cell envelope targeting antibiotics
技術手段：轉錄(lu)組
派森(sen)諾生物與上海交通大學攜手合作，在《Biosensors and Bioelectronics》上發表了一篇(pian)關于鏈霉(mei)菌全(quan)細胞生物傳(chuan)感器，可用于微(wei)生物藥物篩(shai)選和(he)抗生素檢測。
本研(yan)究的轉錄(lu)組測序(xu)和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
細(xi)胞被(bei)膜(mo)靶向(xiang)抗(kang)生(sheng)素是治療各種細(xi)菌(jun)(jun)感(gan)染的(de)有效藥物。然而，目前(qian)的(de)藥物篩選方法繁(fan)瑣，缺乏足夠(gou)的(de)特(te)異性(xing)和敏感(gan)性(xing)。細(xi)菌(jun)(jun)全細(xi)胞生(sheng)物傳感(gan)器能夠(gou)利用細(xi)胞內的(de)特(te)異性(xing)識別元件感(gan)知特(te)定生(sheng)物分子，具有低(di)成(cheng)本、易操作、高靈敏度和強(qiang)特(te)異性(xing)等特(te)點，因(yin)此適用于(yu)微生(sheng)物活(huo)性(xing)天(tian)然產物的(de)高效篩選。 在這里(li)，利用(yong)轉(zhuan)錄(lu)組學分析了(le)(le)(le)(le)鏈霉菌M1146在4中不同類(lei)(lei)型的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)被膜靶向抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)（桿菌肽(tai)、黃霉素(su)、萬古霉素(su)和(he)多粘菌素(su)E）處理下的(de)(de)(de)(de)(de)基因表(biao)達(da)差異(yi)，顯示糖肽(tai)類(lei)(lei)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)（萬古霉素(su)類(lei)(lei)）可(ke)顯著激活VanS/R雙(shuang)組分系(xi)統。因此，設計了(le)(le)(le)(le)一對基于VanS/R的(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)(gan)器(qi)，對糖肽(tai)類(lei)(lei)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)具有(you)高(gao)靈敏(min)度(du)和(he)強特異(yi)性(xing)(xing)(xing)。此外，為(wei)了(le)(le)(le)(le)擴大生(sheng)(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)(gan)器(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)范(fan)圍，通過啟動子(zi)篩(shai)選和(he)表(biao)征，構建了(le)(le)(le)(le)可(ke)特異(yi)性(xing)(xing)(xing)檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)被膜靶向抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)全細(xi)胞(bao)生(sheng)(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)(gan)器(qi)，并(bing)系(xi)統性(xing)(xing)(xing)評估和(he)表(biao)征了(le)(le)(le)(le)傳(chuan)感(gan)(gan)性(xing)(xing)(xing)能(neng)，證(zheng)實了(le)(le)(le)(le)其在高(gao)效篩(shai)選與鑒定細(xi)胞(bao)被膜靶向抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)產生(sheng)(sheng)菌方面的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)靠(kao)性(xing)(xing)(xing)、準(zhun)確性(xing)(xing)(xing)和(he)高(gao)效性(xing)(xing)(xing)。該(gai)生(sheng)(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)(gan)器(qi)不僅(jin)在微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)藥(yao)物(wu)篩(shai)選中具有(you)較好應用(yong)，也(ye)為(wei)檢(jian)測(ce)體液(ye)或高(gao)度(du)污染等環(huan)境樣本的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)殘(can)留提供了(le)(le)(le)(le)潛(qian)在的(de)(de)(de)(de)(de)工具。
技術路線
分析結果
1. 開發多功能全細胞(bao)生物傳(chuan)感(gan)器，能夠檢(jian)測細胞(bao)被膜靶向抗生素(su) 為了篩選用于開發抗生(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)敏感(gan)生(sheng)(sheng)物(wu)傳感(gan)器的(de)(de)調控元件，對S. coelicolor M1146進行了轉(zhuan)錄組學比較分析，其中(zhong)桿菌肽、黃霉素(su)(su)(su)和萬古霉素(su)(su)(su)抑制了細胞壁的(de)(de)合成，多粘菌素(su)(su)(su)E破壞了細胞膜的(de)(de)完整(zheng)性。有91個基(ji)因(yin)在4種靶向抗生(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)處理組中(zhong)共(gong)同差異(yi)表達(圖1c)，這表明盡管抗生(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)靶點不同，但仍有一些保守的(de)(de)反(fan)應。GO富集顯示，大多數(shu)基(ji)因(yin)參與與體內平衡相(xiang)關的(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)過程。從(cong)分子功(gong)能的(de)(de)角度來說，這些共(gong)同差異(yi)表達的(de)(de)基(ji)因(yin)主要與跨膜轉(zhuan)運(yun)蛋白(bai)復(fu)合物(wu)、ATP結(jie)合（ABC)轉(zhuan)運(yun)蛋白(bai)復(fu)合物(wu)以及其他(ta)轉(zhuan)運(yun)蛋白(bai)的(de)(de)功(gong)能相(xiang)關 (圖1d)。 研(yan)究人員基(ji)(ji)于P2CS數據庫在(zai)S. coelicolor染色體上鑒(jian)定了(le)188個TCS相關基(ji)(ji)因，他們編(bian)碼87個應(ying)答(da)調節蛋白和(he)101個傳(chuan)感器(qi)組氨酸激酶。這些TCSs及其靶向啟動(dong)子可(ke)以用于定制生物傳(chuan)感器(qi)，能夠以高靈敏度和(he)特異(yi)性(xing)檢測抗生素。 圖1 轉錄組分析 2、利用VanS/R構建GPA依(yi)賴(lai)性全細胞生(sheng)物傳感器 在(zai)差(cha)異表(biao)達的TCSs中，VanS/R TCS的應答調節蛋白VanR (SCO3590)為(wei)最顯(xian)著(zhu)的差(cha)異基因(yin)(圖2a)，VanR同源的傳感器激酶VanS、VanS/R依賴性(xing)(xing)糖(tang)肽(tai)耐藥基因(yin)vanH, vanA和vanX以(yi)及其他(ta)VanS/R TCS相關(guan)基因(yin)vanK、vanJ在(zai)萬古(gu)霉素(su)處理組中顯(xian)著(zhu)上調(圖2b)。VanA與(yu)其同源蛋白DdlA在(zai)細胞壁合(he)成中有協同作用。研究發現ddlA破壞后，細菌必須完全依賴于萬古(gu)霉素(su)類的糖(tang)肽(tai)抗生素(su)(GPAs)誘導的vanA表(biao)達來(lai)維持正常細胞壁的完整性(xing)(xing)(圖2c)。 通過(guo)用(yong)vanA取代必需(xu)基(ji)因(yin)ddlA來開(kai)發GPA依(yi)賴性全細胞(bao)生(sheng)物(wu)傳感器，DdlA失活(huo)突變體WHY01在(zai)(zai)不添(tian)加(jia)萬(wan)古(gu)(gu)(gu)霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)的(de)(de)培(pei)養基(ji)中幾(ji)乎無法生(sheng)長(chang)(chang)，只有(you)在(zai)(zai)添(tian)加(jia)萬(wan)古(gu)(gu)(gu)霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)的(de)(de)培(pei)養基(ji)中才能(neng)正(zheng)常生(sheng)長(chang)(chang)(圖2e)。生(sheng)物(wu)傳感器WHY01在(zai)(zai)≤0.5 μg/mL萬(wan)古(gu)(gu)(gu)霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)時，WHY01的(de)(de)生(sheng)長(chang)(chang)受到抑制，而在(zai)(zai)≥0.75 μg/mL萬(wan)古(gu)(gu)(gu)霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)時，其生(sheng)長(chang)(chang)良好(圖2f)。WHY01極低(di)的(de)(de)檢(jian)(jian)出限(xian)使其能(neng)夠特異性地檢(jian)(jian)測低(di)濃度(du)的(de)(de)萬(wan)古(gu)(gu)(gu)霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)類(lei)的(de)(de)糖肽(tai)類(lei)抗生(sheng)素(su)(su)，具(ju)有(you)極大(da)的(de)(de)應(ying)用(yong)潛力(li)。 圖2 GPA依(yi)賴性全細(xi)胞生物傳感器WHY01的研制與(yu)表征(zheng) 3、設(she)計(ji)一種功能(neng)互補(bu)的(de)生(sheng)物傳感器，可用于高通(tong)量篩選GPAs產生(sheng)菌株 在萬古霉素處理下，差異倍數最大(da)的(de)(de)基(ji)(ji)因與VanS/R依賴(lai)性(xing)糖(tang)肽抗(kang)性(xing)(SCO3589- SCO3596)相關(圖(tu)3a)，包括vanSR (SCO3589和(he)SCO3590);vanJ (SCO3592);vanK (SCO3593);和(he)vanHAX (SCO3594、SCO3595和(he)SCO3596)。PvanRS, PvanJ,, PvanK和(he)PvanHAX 四個(ge)啟(qi)動子的(de)(de)表達(da)(da)量分別約為 1.0×103-fold, 6.0×103-fold, 6.4×103-fold和(he)1.3×105-fold)(圖(tu)3b)。通過使(shi)用luxCDABE作為報告(gao)基(ji)(ji)因，選擇(ze)中等(deng)表達(da)(da)強度的(de)(de)PvanJ和(he)最高(gao)表達(da)(da)強度的(de)(de)PvanHAX啟(qi)動子來單獨驅動luxCDABE的(de)(de)表達(da)(da)(圖(tu)3c)，構建(jian)了重組(zu)菌(jun)株WHY02和(he)WHY03。總體而言， 含PvanHAX的(de)(de)重組(zu)菌(jun)株WHY03表現(xian)出更寬的(de)(de)動態(tai)范圍和(he)更高(gao)的(de)(de)響(xiang)應靈敏度，具有更優越的(de)(de)生(sheng)(sheng)物傳(chuan)感器性(xing)能。使(shi)用WHY03實現(xian)了對不同GPAs生(sheng)(sheng)產菌(jun)株的(de)(de)發酵培養物中GPA的(de)(de)高(gao)靈敏度和(he)準確性(xing)檢測(圖(tu)3)。 圖(tu)3 功能互補的(de)GPA特異性生物傳(chuan)感器的(de)設計和表征，用于高效篩(shai)選GPA誘導菌株(zhu) 4、開(kai)發具(ju)有更廣(guang)泛(fan)傳(chuan)感能力的多功能生物(wu)傳(chuan)感器 為(wei)了設計(ji)一(yi)種更通用(yong)、應用(yong)場(chang)景更廣泛的(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)器，通過(guo)比較轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組學和(he)啟動(dong)子(zi)篩選相結合(he)的(de)(de)(de)研究模(mo)式(shi)，將(jiang)傳(chuan)感(gan)器的(de)(de)(de)檢測范圍實(shi)現(xian)(xian)(xian)了由點（糖肽類(lei)抗生(sheng)素）到面（細(xi)(xi)胞(bao)被膜靶向(xiang)抗生(sheng)素）的(de)(de)(de)拓展，開發(fa)了可定向(xiang)檢測包含糖肽類(lei)在內的(de)(de)(de)各類(lei)細(xi)(xi)胞(bao)被膜靶向(xiang)抗生(sheng)素的(de)(de)(de)全細(xi)(xi)胞(bao)生(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)器。轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組分析發(fa)現(xian)(xian)(xian)有(you)(you)11個基(ji)因(yin)在所有(you)(you)處理條件(jian)下均上調表達，這(zhe)些(xie)基(ji)因(yin)可能(neng)(neng)位于8個不同的(de)(de)(de)操縱(zong)子(zi)區域(圖4a, b)。將(jiang)這(zhe)8個操縱(zong)子(zi)區域預測的(de)(de)(de)啟動(dong)子(zi)與無(wu)啟動(dong)子(zi)的(de)(de)(de)luxCDABE融合(he)，一(yi)共得到8株(zhu)重(zhong)(zhong)組菌(jun)株(zhu)，其中含有(you)(you)PSCO3089的(de)(de)(de)重(zhong)(zhong)組菌(jun)株(zhu)在所有(you)(you)8個重(zhong)(zhong)組菌(jun)株(zhu)中具有(you)(you)最卓越的(de)(de)(de)性能(neng)(neng)，將(jiang)其命(ming)名(ming)為(wei)WHY04，通過(guo)數學建模(mo)和(he)性能(neng)(neng)測試， WHY04對各種細(xi)(xi)胞(bao)被膜靶向(xiang)化合(he)物(wu)表現(xian)(xian)(xian)出很高的(de)(de)(de)靈敏度、快速的(de)(de)(de)響應時間和(he)較高的(de)(de)(de)特異性(圖4)。 圖4檢測細(xi)胞被膜靶(ba)向(xiang)抗生素的(de)生物傳感器的(de)開(kai)發、性能表征 5、細胞(bao)被(bei)膜(mo)靶向(xiang)化合(he)物(wu)合(he)成的高通量篩選 為(wei)了(le)進一步研究WHY04在高(gao)通(tong)量篩(shai)選(xuan)(xuan)細(xi)胞被膜(mo)靶(ba)向抗(kang)生素產(chan)生菌方面(mian)(mian)的(de)(de)應用潛力。利用WHY04對實驗(yan)室前期保藏的(de)(de)166株(zhu)(zhu)(zhu)菌株(zhu)(zhu)(zhu)進行了(le)高(gao)通(tong)量篩(shai)選(xuan)(xuan)，鑒定出17株(zhu)(zhu)(zhu)菌株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)發(fa)酵上清液可(ke)(ke)顯著(zhu)誘導WHY04產(chan)生發(fa)光信號，表明(ming)這些菌株(zhu)(zhu)(zhu)可(ke)(ke)能合成了(le)細(xi)胞被膜(mo)靶(ba)向的(de)(de)活性產(chan)物(wu)。該生物(wu)傳感器(qi)的(de)(de)創制可(ke)(ke)以顯著(zhu)加(jia)快天(tian)然產(chan)物(wu)的(de)(de)挖掘(jue)速度，有望在新藥篩(shai)選(xuan)(xuan)方面(mian)(mian)得到極大的(de)(de)應用。
結 論
在本研究中，探索了(le)S. coelicolor M1146對四種細(xi)(xi)胞(bao)被膜靶向抗(kang)生(sheng)素(su)的(de)轉(zhuan)錄反應(ying)，確定(ding)能(neng)夠(gou)檢(jian)測(ce)(ce)并(bing)響應(ying)這(zhe)些化合物(wu)(wu)的(de)調控元件，以及(ji)也(ye)可(ke)以用(yong)作(zuo)生(sheng)物(wu)(wu)傳感器中的(de)調控元件。開發了(le)能(neng)夠(gou)檢(jian)測(ce)(ce)細(xi)(xi)胞(bao)被膜靶向抗(kang)生(sheng)素(su)的(de)生(sheng)物(wu)(wu)傳感器，通過(guo)采用(yong)數(shu)學建模和性(xing)(xing)能(neng)測(ce)(ce)試，全(quan)面(mian)評(ping)估了(le)該(gai)生(sheng)物(wu)(wu)傳感器的(de)性(xing)(xing)能(neng)，該(gai)生(sheng)物(wu)(wu)傳感器具有(you)高動態范圍(wei)、廣(guang)泛的(de)抗(kang)生(sheng)素(su)識別種類和明確的(de)劑量-反應(ying)關系。這(zhe)種優異(yi)的(de)性(xing)(xing)能(neng)有(you)效地(di)克服(fu)了(le)現有(you)生(sheng)物(wu)(wu)傳感器遇到的(de)局限性(xing)(xing)，極大地(di)促進了(le)細(xi)(xi)胞(bao)被膜靶向的(de)新(xin)型抗(kang)生(sheng)素(su)的(de)發現。 圖5 研究路線(xian)
原文索引： [1]Wang, H., Sheng, Y., Ou, Y., Xu, M., Tao, M., Lin, S., Deng, Z., Bai, L., Ding,W., Kang, Q., Streptomyces-based whole-cell biosensors for detecting diverse cell envelope-targetingantibiotics, Biosensors and Bioelectronics (2024), doi: //doi.org/10.1016/j.bios.2024.116004.
