2024-04-10
文章題目: Microenvironment-responsive metal-phenolic network release platform with ROS scavenging, anti-pyroptosis, and ECM regeneration for intervertebral disc degeneration
技術手段：轉錄(lu)組測序、SEM 和TEM、細(xi)胞活性評估(gu)、熒(ying)光染色(se)、RT-qPCR等
中南大學湘雅(ya)三醫院，鄧幼文教授團隊在(zai)《Bioactive Materials》上發表了(le)基于當前IVDD的(de)治療(liao)困境，創新性的(de)開發了(le)一款多(duo)功(gong)能微環境響應型的(de)金屬酚網絡釋放平臺的(de)研究成果。
本研究的(de)轉錄組測序和部分(fen)數(shu)據分(fen)析工(gong)作由上海派森諾生物科技(ji)股份有限公司完成。
研究(jiu)背景
椎間盤退變(IVDD)是一種以一系列病理改變為(wei)特征的復雜疾病，對生活(huo)質量和健康產生負面(mian)影響，雖然保(bao)守(shou)治療(liao)(liao)可以有效緩解(jie)疼(teng)痛(tong)，但并不能減緩IVDD的進展因此(ci)，單靶(ba)點治療(liao)(liao)是不夠(gou)的。因此(ci)，為(wei)了有效治療(liao)(liao)IVDD，迫切需要(yao)開發多靶(ba)點藥(yao)物(wu)治療(liao)(liao)。
越來越多(duo)的(de)證據表明，IVDD與氧(yang)化應激產(chan)生、細胞焦(jiao)亡和細胞外基質(zhi)(ECM)降解(jie)密切相關。活性氧(yang)(ROS)過量，主(zhu)要(yao)由線粒(li)體產(chan)生，可引(yin)起組織損傷。
本研究擬通過以TA（單寧酸）、錳和聚乙烯吡(bi)羅(luo)烷酮(tong)(PVP)為原料，通過自(zi)組裝，開發具有高效ROS清除活性的TA衍(yan)生金屬-酚類網絡(TA- mn -PVP, TMP)，并評(ping)估其(qi)對IL-1β誘導的IVDD的療效。
平臺制備方(fang)法、椎間盤注射及(ji)治(zhi)療效果示意圖(tu)
技(ji)術路(lu)線
主要研究結果
1.能量(liang)代謝產物和酶(mei)活性的變化(hua)
為了(le)更(geng)好地了(le)解(jie)IVDD發(fa)病時組織發(fa)生(sheng)的(de)病理(li)變化(hua)，本研究收(shou)集了(le)IVDD患(huan)者的(de)髓核(he)組織標本。通過MRI圖像，番(fan)紅-固綠染色，免疫組織化(hua)學，半定(ding)量以及IVD組織中(zhong)(zhong)關(guan)鍵的(de)焦亡(wang)相關(guan)蛋白的(de)表達評(ping)估等(deng)方法(fa)，這些結果(guo)均表明，焦亡(wang)促進了(le)IVDD的(de)進展(zhan)。ROS與焦亡(wang)和ECM降解(jie)密切相關(guan)，并在IVDD的(de)發(fa)展(zhan)中(zhong)(zhong)也起著同(tong)樣重(zhong)要(yao)的(de)作用（圖1）。另外(wai)活性氧的(de)存在促進細胞焦亡(wang)和ECM降解(jie)。因(yin)此，去除活性氧在治療IVDD中(zhong)(zhong)同(tong)樣至(zhi)關(guan)重(zhong)要(yao)。
圖1：臨床退行性(xing)髓核組織標(biao)本的病(bing)理改變
2.TMP 納米顆粒(li)的(de)表征
本研究利(li)用FTIR光(guang)譜(pu)，SEM 和TEM，元素圖譜(pu)顯微鏡(jing)，熱重(zhong)分析，全掃描 XPS 測(ce)量光(guang)譜(pu)等表征(zheng)測(ce)定（圖2），TA-Mn金屬多酚網絡具有合(he)成步驟(zou)簡單、成本效益(yi)高且易于執行對的特點，因此(ci)它非(fei)常適(shi)合(he)大規模(mo)合(he)成。
圖2：TMP納(na)米顆(ke)粒的合(he)成與表征
3.TMP清除ROS的活性能(neng)力
在表征 TMP NP后，進(jin)一(yi)步(bu)探(tan)討了它們(men)的 ROS 清除能力。TMP NPs 表現出濃度依(yi)賴(lai)性的自由基清除速率和能力（圖3A-D）。
在(zai)化學水平上(shang)表征了(le)(le)納米粒(li)子對 ROS 的(de) ROS 清除(chu)性(xing)能后，本研(yan)究(jiu)還觀察了(le)(le)細胞中的(de) ROS 清除(chu)性(xing)能。在(zai)本研(yan)究(jiu)中，IL-1β刺(ci)激導(dao)致細胞產生過(guo)(guo)量(liang)的(de)ROS，這(zhe)一(yi)(yi)(yi)點通過(guo)(guo)氧(yang)化應(ying)激探針（DCFH-DA）得到證實(shi)；相反，與TMP NPs一(yi)(yi)(yi)起孵(fu)育后，熒(ying)光(guang)顯著(zhu)減(jian)弱(ruo)，并且隨著(zhu)TMP NPs濃(nong)度(du)的(de)增(zeng)加，ROS熒(ying)光(guang)進一(yi)(yi)(yi)步減(jian)弱(ruo)。半定量(liang)分析證實(shi)了(le)(le)納米顆粒(li)具有很強的(de) ROS清除(chu)特性(xing)（圖(tu)3E-K）。
以上結果均證實了NPs改善了線粒(li)體活(huo)性。
圖(tu)3：TMP納米顆粒(li)ROS清(qing)除活(huo)性
4.TMP@Alg-PBA/PVA 水(shui)凝膠釋放平臺的表征
本研究用FTIR 分析，SEM分析，流變學表征和(he)凝膠降解測試等方法證明了(le)該釋放(fang)平臺的特性有望用于IVD 注射（圖4）。
圖4：TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠(jiao)釋放(fang)平臺的表征(zheng)
5.TMP NP 的細胞攝取、溶酶(mei)體(ti)逃逸(yi)和線(xian)粒體(ti)積累
細(xi)胞(bao)攝取納米(mi)粒子(zi)的(de)效(xiao)(xiao)率對于(yu)治療(liao)效(xiao)(xiao)率至(zhi)關(guan)重要。本研究通過將TMP NP附著在(zai) CY5 熒光上并加載到水凝(ning)膠(jiao)(jiao)中(zhong)，觀察(cha)負載濃度和納米(mi)粒子(zi)的(de)吸收效(xiao)(xiao)率，并進(jin)一步通過細(xi)胞(bao)活、死染色以及(ji)溶血實(shi)驗證實(shi)了100 μg/mL和 200 μg/mL NP的(de)TMP@Alg-PBA/PVA水凝(ning)膠(jiao)(jiao)表現出良(liang)好的(de)生物相容(rong)性。
半定量分析，流式細(xi)胞術(shu)，線(xian)粒(li)體追蹤器熒光標記等一系列(lie)實驗表明納米(mi)粒(li)子被(bei)細(xi)胞吸(xi)收后(hou)，可(ke)以(yi)通過溶酶體逃逸釋放到細(xi)胞質中，然后(hou)靶(ba)向(xiang)線(xian)粒(li)體區域，以(yi)促進TMP更有(you)效地清除(chu)ROS（圖5）。
圖5：MP納(na)米(mi)顆粒的細胞攝取、溶酶體逃逸和(he)線(xian)粒體積累
6.TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠釋放平臺(tai)對體外細胞焦(jiao)亡(wang)的影響
ROS的積累和(he)線粒體毒性(xing)可(ke)以通過(guo)多種途徑(jing)介導細胞焦(jiao)亡。IL-1β是(shi)一(yi)種極具代表(biao)性(xing)的促炎(yan)因(yin)子(zi)，用CCK-8 檢測試(shi)劑盒來(lai)量化(hua)(hua) IL-1β 對(dui) NPC 死亡的影響。圖6A顯示(shi)了水凝膠(jiao)與NPC共培養的可(ke)視(shi)化(hua)(hua)表(biao)示(shi)。對(dui)每組(zu)進行了CCK-8測定，結果表(biao)明(ming)與Gel組(zu)和(he)對(dui)照組(zu)相比，處理組(zu)的細胞活(huo)性(xing)以濃度依(yi)賴性(xing)方式顯著提(ti)高(gao)（圖6B），PI 染色實驗(yan)表(biao)明(ming)凝膠(jiao)組(zu)和(he)對(dui)照組(zu)的死細胞數(shu)量明(ming)顯高(gao)于空(kong)白組(zu)（圖6C）。
細(xi)胞(bao)膜(mo)破裂(lie)和裂(lie)解代(dai)表(biao)(biao)了細(xi)胞(bao)焦亡的(de)關鍵特(te)征LDH 檢測試劑(ji) 盒顯示對(dui)照組(zu)(zu)和凝膠(jiao)組(zu)(zu)的(de)LDH水平(ping)顯著增加。相(xiang)反，TMP@AlgPBA/PVA組(zu)(zu)表(biao)(biao)現出(chu)LDH積累減少，表(biao)(biao)明細(xi)胞(bao)膜(mo)破裂(lie)減少（圖(tu)6D）。此外， SEM顯示IL-1β組(zu)(zu)細(xi)胞(bao)膜(mo)表(biao)(biao)面的(de)孔數量顯著增加，并伴有碎片細(xi)胞(bao)膜(mo)上的(de)球狀突起。相(xiang)反，處理組(zu)(zu)和空白組(zu)(zu)的(de)細(xi)胞(bao)形態表(biao)(biao)現出(chu)伸長和堅固的(de)細(xi)胞(bao)膜(mo)完整性（圖(tu)6E）。
推論(lun)該(gai)(gai)平臺(tai)可能通過抑制細(xi)胞焦(jiao)亡(wang)來減輕上(shang)述(shu)現象，并通過RT-qPCR實(shi)驗，在基因水(shui)平上(shang)，與其他(ta)組相比，治療組IL-1β和TNF-α mRNA的表達(da)顯著降低（圖6F），在蛋(dan)(dan)白質水(shui)平上(shang)，免(mian)疫熒光評估了(le)與細(xi)胞焦(jiao)亡(wang)相關(guan)的經(jing)典蛋(dan)(dan)白質的表達(da)，證明了(le)該(gai)(gai)平臺(tai)的抗焦(jiao)亡(wang)特性(xing)。蛋(dan)(dan)白質印(yin)跡分析也證實(shi)了(le)相同的結論(lun)（圖6H）。
圖6：TMP@Alg-PBA/PVA對焦亡(wang)的影響(xiang)
7.TMP@Alg-PBA/PVA水(shui)凝膠釋放平臺制(zhi)造(zao)細胞焦亡(wang)的潛在機制(zhi)
為了評估(gu)NPC基(ji)因表達的(de)變化，進行了高通(tong)(tong)量 mRNA測(ce)序來分(fen)析細胞(bao)內(nei)mRNA的(de)變化（圖(tu)(tu)7A）。治(zhi)療(liao)組(zu)與IL-1β組(zu)進行比較時，1472個基(ji)因上(shang)調，1495個基(ji)因下調（圖(tu)(tu)7B），差異基(ji)因GO富集分(fen)析結(jie)果顯示(shi)DEGs主要與發(fa)育過程、細胞(bao)對化學刺激的(de)反應、細胞(bao)分(fen)化、ECM、含有膠原蛋(dan)白(bai)的(de)細胞(bao)外(wai)空間、蛋(dan)白(bai)質或(huo)信號(hao)(hao)通(tong)(tong)路(lu)(lu)結(jie)合(he)和激活有關。KEGG富集分(fen)析結(jie)果顯示(shi)治(zhi)療(liao)組(zu)中TNF信號(hao)(hao)通(tong)(tong)路(lu)(lu)、IL-17信號(hao)(hao)通(tong)(tong)路(lu)(lu)、細胞(bao)周期和Toll樣受體信號(hao)(hao)通(tong)(tong)路(lu)(lu)的(de)下調（圖(tu)(tu)7D）。IL-17信號(hao)(hao)通(tong)(tong)路(lu)(lu)被顯著抑制（圖(tu)(tu)7E）。
作者進一步用(yong)WB測定驗證了IL-17誘導的(de)(de)細(xi)胞焦亡(wang)相關(guan)信號通(tong)路中關(guan)鍵蛋白的(de)(de)表(biao)達（圖7F）。綜上，這些結果表(biao)明 TMP@Alg-PBA/PVA 可能通(tong)過抑(yi)制 NPC中的(de)(de) IL-17/ERK信號通(tong)路來減少細(xi)胞焦亡(wang)，從而為(wei) IVDD治療(liao)提供新的(de)(de)可能靶點(dian)。
圖7：轉(zhuan)錄組測(ce)序分析以及WB驗證
8.TMP@Alg-PBA/PVA處理后(hou)ECM的變化
作者利用(yong)IL-1β刺(ci)激NPC并模擬炎癥環境對ECM的(de)(de)影(ying)響。這(zhe)些結果表明，TMP@Alg-PBA/PVA 平臺抵消(xiao)了IL-1β對ECM的(de)(de)有害影(ying)響，顯示出IVD修(xiu)復和再生的(de)(de)前景（圖 8）。
圖 8. 炎癥環(huan)境中 TMP@Alg-PBA/PVA 對 ECM 的(de)影響
研(yan)究結論
在這項研究中，作者開發了(le)一個多功能(neng)(neng)和微環境響應的(de)金屬(shu)-酚網(wang)絡釋(shi)放(fang)平(ping)臺(tai)(TMP@Alg-PBA/PVA)，該(gai)平(ping)臺(tai)裝載了(le)TMP NPs，體(ti)外研究表明(ming)，該(gai)平(ping)臺(tai)釋(shi)放(fang)的(de)金屬(shu)-酚網(wang)絡(TA-Mn-PVP, TMP)靶(ba)向(xiang)線粒(li)體(ti)，有(you)效清除ROS，減少ECM降解。通過抑制IL-17/ERK信號(hao)通路抑制焦(jiao)亡。這些發現(xian)證明(ming)了(le)該(gai)平(ping)臺(tai)的(de)多功能(neng)(neng)性。另外在IVDD大鼠模型中，TMP@Alg-PBA/PVA通過減緩疾病(bing)進展表現(xian)出(chu)優異的(de)治療效果（圖9.10.11）。
總(zong)體而(er)言(yan)，該平臺(tai)(tai)具有治療IVDD的治療潛力(li)，值得進一(yi)步(bu)(bu)系統的臨床前研究。IL-17/ERK信號通路(lu)作為該平臺(tai)(tai)對IVDD影響(xiang)的分子因子的鑒定進一(yi)步(bu)(bu)提(ti)供了治療焦亡的潛在靶點(dian)。
