1.卵(luan)巢具有生育和激素分(fen)泌功能，隨著年齡增加，卵(luan)巢功能在(zai)大(da)約20-30歲時達到頂峰(feng)，30歲后開始下降，然(ran)后在(zai)50歲左右衰竭。

2.大多(duo)數女性(xing)會(hui)在45至55歲之間絕經，此階段卵(luan)巢(chao)內卵(luan)泡耗竭，血液(ye)中雌(ci)激素水平下(xia)降(jiang)，可能(neng)會(hui)導致心(xin)血管(guan)疾(ji)病、骨質疏松、老年癡(chi)呆、肥胖(pang)癥(zheng)、腫瘤等疾(ji)病的發生，因此卵(luan)巢(chao)衰(shuai)老被喻(yu)為(wei)女性(xing)機體衰(shuai)老的起搏(bo)器(qi)。

3.高分辨(bian)率的(de)單(dan)細(xi)胞(bao)RNA測序（scRNA-seq）技術可以用來研究(jiu)細(xi)胞(bao)異質(zhi)性，繪(hui)制器官衰老圖譜。目(mu)前已有(you)一些(xie)研究(jiu)鑒定了人類(lei)(lei)(lei)卵巢(chao)(chao)(chao)組織中包含的(de)細(xi)胞(bao)類(lei)(lei)(lei)型，以及小鼠和(he)靈(ling)長(chang)類(lei)(lei)(lei)動物卵巢(chao)(chao)(chao)衰老過程(cheng)中的(de)細(xi)胞(bao)變(bian)化，但是人類(lei)(lei)(lei)卵巢(chao)(chao)(chao)衰老過程(cheng)中的(de)細(xi)胞(bao)類(lei)(lei)(lei)型和(he)轉錄調(diao)控(kong)變(bian)化目(mu)前仍然未(wei)知(zhi)。

4.卵(luan)巢發(fa)育是一(yi)個動態的過程(cheng)，因此了解卵(luan)巢空(kong)間(jian)結(jie)構對于(yu)卵(luan)巢的衰老動力學(xue)研究是非常(chang)有(you)必(bi)要的。空(kong)間(jian)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)學(xue)可以(yi)將轉(zhuan)錄(lu)本(ben)映(ying)射到組(zu)織切(qie)片(pian)上，實現(xian)基因表(biao)達的空(kong)間(jian)可視化，有(you)助于(yu)進一(yi)步探索卵(luan)巢衰老過程(cheng)中的空(kong)間(jian)轉(zhuan)錄(lu)變化。

單細胞轉錄組：

來自于9名(ming)捐獻者的(de)卵巢樣本，被分為3組，分別是年(nian)輕組（Y）、中年(nian)組（M）和老年(nian)組（O）；

空間轉錄組：

來自于(yu)15名捐獻(xian)者的卵(luan)巢(chao)樣本，被分為3組(zu)，分別是年(nian)輕組(zu)（Y）、中年(nian)組(zu)（M）和老年(nian)組(zu)（O）；

作者對來源于9名患者的卵巢樣本進(jin)(jin)(jin)行(xing)解離并(bing)進(jin)(jin)(jin)行(xing)10x上機，經過質(zhi)控共(gong)獲得(de)92965個細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。對這些(xie)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)進(jin)(jin)(jin)行(xing)降維(wei)聚類(lei)分群(qun)并(bing)通(tong)過經典的細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)marker基因注釋(shi)，最終得(de)到(dao)8種細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)，分別是顆粒細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（GCs）、卵母細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、卵泡膜和(he)基質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（T&S cells）、內皮細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（ECs）、平(ping)滑肌細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（SMCs）、單(dan)(dan)核細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、NK細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（圖1a-b）。每種細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)的marker基因的GO富(fu)集分析(xi)結(jie)果顯示，GCs中主要富(fu)集的通(tong)路(lu)與(yu)調節激素水平(ping)相關(guan)，卵母細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中的富(fu)集通(tong)路(lu)與(yu)卵母細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分化有關(guan)，T&S cells主要富(fu)集到(dao)了“細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)外(wai)基質(zhi)”和(he)“膽固(gu)醇轉移活(huo)性(xing)”通(tong)路(lu)，而(er)SMCs顯示出在“肌肉(rou)系統過程”和(he)“細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)骨(gu)架組織(zhi)”通(tong)路(lu)中富(fu)集。這也側面驗證了單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)注釋(shi)的準確性(xing)（圖1c）。

作者對來源于(yu)15名患者的(de)卵巢樣本進行OCT包(bao)埋并(bing)做(zuo)空(kong)(kong)間轉錄(lu)組(zu)測序。通過單細(xi)(xi)(xi)胞數(shu)(shu)據和(he)空(kong)(kong)轉數(shu)(shu)據的(de)聯合分(fen)析，對空(kong)(kong)轉數(shu)(shu)據進行了注釋，識別出了位于(yu)卵泡中心的(de)卵母細(xi)(xi)(xi)胞（圖(tu)1d (i))、卵泡周圍的(de)GCs（圖(tu)1d（ii）)、廣(guang)泛(fan)分(fen)布(bu)的(de)T&S細(xi)(xi)(xi)胞（圖(tu)1d（iii）)和(he)沿血管分(fen)布(bu)的(de)SMC/內皮(pi)細(xi)(xi)(xi)胞（圖(tu)1d（iv）/(v)）。而(er)免疫細(xi)(xi)(xi)胞，包(bao)括單核細(xi)(xi)(xi)胞、NK細(xi)(xi)(xi)胞和(he)T淋巴細(xi)(xi)(xi)胞，主要分(fen)布(bu)于(yu)卵巢髓質（圖(tu)1d（vi）、（vii）、（viii））。

圖1：人類卵巢組(zu)織的單細胞和空(kong)間轉(zhuan)錄圖譜

作者(zhe)(zhe)對(dui)(dui)8種細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)中(zhong)(zhong) O/Y、M/Y 和(he) O/M 組(zu)之(zhi)間進(jin)行(xing)了(le)差(cha)異(yi)富(fu)集(ji)分(fen)析，發(fa)(fa)現(xian)上調(diao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)差(cha)異(yi)基(ji)因富(fu)集(ji)到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)KEGG通(tong)路(lu)(lu)(lu)主要與細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)和(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)相(xiang)關(guan)通(tong)路(lu)(lu)(lu)有(you)關(guan)，比如FoxO 信號(hao)通(tong)路(lu)(lu)(lu), IL-17 信號(hao)通(tong)路(lu)(lu)(lu), nuclear factor (NF)-κB 信號(hao)通(tong)路(lu)(lu)(lu), NOD-like receptor信號(hao)通(tong)路(lu)(lu)(lu)等，下(xia)調(diao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)差(cha)異(yi)基(ji)因富(fu)集(ji)到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)KEGG通(tong)路(lu)(lu)(lu)主要與細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)遷移、細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)外(wai)基(ji)質(zhi)（ECM）-受體相(xiang)互作用、雌激素(su)信號(hao)通(tong)路(lu)(lu)(lu)、細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)外(wai)囊(nang)泡(pao)、氧化(hua)磷酸化(hua)、血小板活化(hua)、肌(ji)動蛋白(bai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)骨(gu)架調(diao)控和(he)緊密連接有(you)關(guan)（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2a）。因此作者(zhe)(zhe)又對(dui)(dui)不(bu)(bu)同(tong)組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)別進(jin)行(xing)了(le)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)評分(fen)，發(fa)(fa)現(xian)在衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)過程中(zhong)(zhong)，大多(duo)數(shu)卵(luan)(luan)(luan)(luan)巢(chao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)信號(hao)通(tong)路(lu)(lu)(lu)評分(fen)增(zeng)(zeng)加（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2b）。空(kong)(kong)間基(ji)因表(biao)達數(shu)據的(de)(de)(de)(de)(de)(de)通(tong)路(lu)(lu)(lu)評分(fen)結果也(ye)同(tong)樣發(fa)(fa)現(xian)，老(lao)(lao)(lao)(lao)年卵(luan)(luan)(luan)(luan)巢(chao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)卵(luan)(luan)(luan)(luan)泡(pao)、皮質(zhi)和(he)髓質(zhi)中(zhong)(zhong)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)和(he)衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)相(xiang)關(guan)分(fen)泌(mi)表(biao)型(xing)（SASP）信號(hao)通(tong)路(lu)(lu)(lu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)富(fu)集(ji)程度提高（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2c）。不(bu)(bu)同(tong)年齡(ling)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)卵(luan)(luan)(luan)(luan)巢(chao)脂褐(he)素(su)染色（脂褐(he)素(su)，細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)志物）結果也(ye)顯示(shi)脂褐(he)素(su)在卵(luan)(luan)(luan)(luan)巢(chao)衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)過程中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)積累(lei)增(zeng)(zeng)加（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2d）。除此之(zhi)外(wai)，不(bu)(bu)管是單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)數(shu)據還是空(kong)(kong)轉數(shu)據，衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)標(biao)志基(ji)因CDKN1A/p21也(ye)在老(lao)(lao)(lao)(lao)年組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)所有(you)卵(luan)(luan)(luan)(luan)巢(chao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)中(zhong)(zhong)均表(biao)達增(zeng)(zeng)加（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2e-f）。多(duo)重免疫組(zu)化(hua) （IHC）結果顯示(shi)，在GCs和(he)T&S細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)，CDKN1A陽性細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)逐(zhu)漸增(zeng)(zeng)加（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2g）。對(dui)(dui)SASPs相(xiang)關(guan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)因子進(jin)行(xing)分(fen)析發(fa)(fa)現(xian)在老(lao)(lao)(lao)(lao)年卵(luan)(luan)(luan)(luan)巢(chao)中(zhong)(zhong)其整體表(biao)達增(zeng)(zeng)加（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2h）。接下(xia)來，作者(zhe)(zhe)還進(jin)一(yi)步做了(le)RT-PCR和(he)Western blot去驗證（見補充數(shu)據）。總之(zhi)，這些發(fa)(fa)現(xian)表(biao)明，老(lao)(lao)(lao)(lao)年人(ren)(ren)類卵(luan)(luan)(luan)(luan)巢(chao)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特定細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)可能表(biao)現(xian)出與細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)相(xiang)關(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)獨特特征(zheng)。

圖2：卵巢衰老轉錄程(cheng)序中的細胞特異性變化

作(zuo)者(zhe)通過(guo)擬(ni)時(shi)序分析幫助確定了(le)(le)卵(luan)母(mu)(mu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)3個(ge)不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)亞(ya)(ya)群（cluster a、b、c），其中(zhong)年(nian)(nian)輕(qing)組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)卵(luan)母(mu)(mu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在(zai)(zai)三種亞(ya)(ya)群都有(you)分布，而(er)中(zhong)年(nian)(nian)組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)卵(luan)母(mu)(mu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)主(zhu)要在(zai)(zai)a組(zu)，老(lao)年(nian)(nian)組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)卵(luan)母(mu)(mu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)主(zhu)要在(zai)(zai)c組(zu)（圖(tu)3a-b）。軌跡(ji)(ji)(ji)分析顯示，年(nian)(nian)輕(qing)組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)卵(luan)母(mu)(mu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)處(chu)于發育軌跡(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)起點，而(er)年(nian)(nian)老(lao)組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)卵(luan)母(mu)(mu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)處(chu)于終點狀態(tai)，提示在(zai)(zai)卵(luan)母(mu)(mu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)衰老(lao)過(guo)程中(zhong)存在(zai)(zai)基(ji)因(yin)(yin)開(kai)關（圖(tu)3c）。分析不(bu)同cluster在(zai)(zai)偽時(shi)間軌跡(ji)(ji)(ji)上的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)表達動(dong)態(tai)變化，發現(xian)三個(ge)階(jie)段分別有(you)749、418和(he)(he)(he)575個(ge)DEGs。對這些DEGs進(jin)行GO富(fu)(fu)集(ji)(ji)(ji)分析，發現(xian)cluster a主(zhu)要富(fu)(fu)集(ji)(ji)(ji)在(zai)(zai)“靶向膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)共翻(fan)譯蛋白(bai)”、“核轉錄的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA分解代謝過(guo)程”和(he)(he)(he)“翻(fan)譯起始”，cluster b在(zai)(zai)“含(han)膠原的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)外基(ji)質(zhi)”、“細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)外基(ji)質(zhi)組(zu)織”和(he)(he)(he)“細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)粘(zhan)附的(de)(de)(de)(de)(de)正(zheng)調節”中(zhong)表現(xian)出富(fu)(fu)集(ji)(ji)(ji)，cluster c中(zhong)則是(shi)“細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)凋亡(wang)”、“雙鏈斷裂修復”和(he)(he)(he)“細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)器裂變”，表明卵(luan)母(mu)(mu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)DNA損(sun)傷和(he)(he)(he)凋亡(wang)（圖(tu)3d）。因(yin)(yin)此(ci)作(zuo)者(zhe)進(jin)一步做了(le)(le)DNA損(sun)傷和(he)(he)(he)修復基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)集(ji)(ji)(ji)合(he)打分，發現(xian)在(zai)(zai)老(lao)年(nian)(nian)卵(luan)母(mu)(mu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)，DNA損(sun)傷評(ping)(ping)分增加，DNA修復評(ping)(ping)分降低（圖(tu)3e）。

單細胞(bao)數據的細胞(bao)通訊分析結(jie)果顯示，卵母(mu)細胞(bao)與(yu)其他細胞(bao)類型之間的相互(hu)作用在(zai)老年(nian)組中顯著增強（圖3f），老年(nian)卵母(mu)細胞(bao)表現出配受體對(dui)MDK-LRP的表達升高(gao)（圖3g）。隨后作者(zhe)又進(jin)行(xing)了空間基因集合評分，發現配受體對(dui)MDK-LRP1在(zai)卵母(mu)細胞(bao)和周圍細胞(bao)中泛(fan)表達，并且在(zai)衰(shuai)老組評分更高(gao)（圖3h）。IHC染色(se)結(jie)果也驗證了這(zhe)一點（圖3i）。

圖3：卵母細(xi)胞在卵巢衰老過程中(zhong)的時空變(bian)化

GCs包(bao)裹著卵母細胞并與其相互作(zuo)用，但GCs在(zai)衰(shuai)老過程中(zhong)分(fen)(fen)類(lei)和變(bian)化目前還(huan)不清楚。因(yin)(yin)(yin)此(ci)作(zuo)者進一步將GCs細分(fen)(fen)為(wei)3種亞(ya)型（GC亞(ya)型1、2和3）（圖(tu)4a）。細胞占比統(tong)計結(jie)果(guo)顯示(shi)，年輕組(zu)GCs以(yi)(yi)(yi)亞(ya)型1和2為(wei)主，而老年組(zu)GCs以(yi)(yi)(yi)亞(ya)型3為(wei)主（圖(tu)4b）。各亞(ya)群(qun)top 8 marker基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)氣泡圖(tu)顯示(shi)，GCs亞(ya)型1表達已知標記基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)如AMH、FST、HSD1S7B1、SERPINE2和PRKAR2B，以(yi)(yi)(yi)及之前未報道的基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)如DSP和MAGED2（圖(tu)4c）。接下來作(zuo)者還(huan)對各亞(ya)群(qun)的marker基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)進行(xing)了(le)GO富集(ji)分(fen)(fen)析，具體結(jie)果(guo)見補充(chong)數據。總之，這些(xie)發現為(wei)深入了(le)解人類(lei)卵巢中(zhong)三個(ge)GCs亞(ya)群(qun)的轉錄特(te)征提供了(le)新見解。

接下來(lai)作者進一步檢測了空轉數據(ju)中(zhong)顆(ke)粒(li)細胞的(de)分布(bu)。值得注(zhu)意的(de)是，三個不(bu)同的(de)GCs亞(ya)(ya)(ya)群在(zai)空間(jian)分布(bu)上具(ju)有明(ming)顯差異(yi)。GCs亞(ya)(ya)(ya)型1位(wei)于竇卵(luan)(luan)泡卵(luan)(luan)丘，2亞(ya)(ya)(ya)型位(wei)于卵(luan)(luan)泡壁(bi)層，3亞(ya)(ya)(ya)型在(zai)卵(luan)(luan)泡中(zhong)廣泛分布(bu)（圖4d）。多重免疫(yi)組(zu)化 （IHC）結果(guo)也驗(yan)證了該發現（圖4e）。

隨(sui)后作者又(you)進一步(bu)用(yong)monocle2分(fen)(fen)析了(le)(le)不(bu)同顆粒(li)亞群(qun)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)動態轉換關系，發(fa)現(xian)(xian)GCs亞型1位于(yu)軌跡路徑的(de)(de)起點(dian)（圖(tu)4f-g）。早期(qi)GCs亞型1主要分(fen)(fen)布于(yu)年(nian)輕和(he)中(zhong)年(nian)卵(luan)巢(chao)(chao)，而老(lao)(lao)(lao)(lao)年(nian)樣本中(zhong)的(de)(de)GCs主要是(shi)分(fen)(fen)布于(yu)末端的(de)(de)GCs亞型3（圖(tu)4h）。為了(le)(le)研究衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)過程中(zhong)顆粒(li)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)通(tong)(tong)路是(shi)否(fou)會發(fa)生變化，我(wo)們計(ji)算了(le)(le)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)評分(fen)(fen)，發(fa)現(xian)(xian)老(lao)(lao)(lao)(lao)年(nian)卵(luan)巢(chao)(chao)中(zhong)所(suo)有三種類型的(de)(de)GCs均有增加（圖(tu)4i）。相應地，CDKN1A在所(suo)有三種GCs亞型中(zhong)也(ye)均表(biao)達(da)(da)上調（見補充數(shu)據）。免疫染色(se)分(fen)(fen)析證實(shi)，老(lao)(lao)(lao)(lao)年(nian)卵(luan)巢(chao)(chao)GCs中(zhong)CDKN1A蛋白水平升高（圖(tu)4j）。空(kong)間轉錄組的(de)(de)基因(yin)集合打分(fen)(fen)也(ye)顯示了(le)(le)老(lao)(lao)(lao)(lao)年(nian)組的(de)(de)GC表(biao)現(xian)(xian)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)和(he)SASPs相關通(tong)(tong)路表(biao)達(da)(da)更高，特(te)別是(shi)GC亞型1（圖(tu)4k-l）。為了(le)(le)進一步(bu)驗證，又(you)對(dui)接受了(le)(le)輔助(zhu)生殖(zhi)治療的(de)(de)21-47歲(sui)(sui)的(de)(de)志愿者取了(le)(le)GCs，以進一步(bu)探索細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)（圖(tu)4m）。結(jie)果發(fa)現(xian)(xian)，隨(sui)著(zhu)年(nian)齡22-47歲(sui)(sui)的(de)(de)增加，SASP相關基因(yin)的(de)(de)表(biao)達(da)(da)逐漸增加（LMNA，P = 0.0019；CDKN1A，P = 0.0269；IL-8，P = 0.0172）（圖(tu)4m）。這些發(fa)現(xian)(xian)表(biao)明，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)通(tong)(tong)路是(shi)GCs衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)的(de)(de)一個(ge)潛在特(te)征，這可能導(dao)致衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)(lao)過程中(zhong)的(de)(de)卵(luan)巢(chao)(chao)功(gong)能下降。

圖4：顆粒細(xi)胞在卵(luan)巢衰(shuai)老過程中的時空變(bian)化

卵巢(chao)(chao)中(zhong)(zhong)(zhong)T&S細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)占比很多(duo)，但T&S 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在(zai)(zai)衰(shuai)老(lao)過程中(zhong)(zhong)(zhong)分類和(he)變化目前還(huan)不清(qing)楚(chu)。因此作(zuo)者進(jin)(jin)一步(bu)(bu)對(dui)T&S 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)進(jin)(jin)行(xing)細(xi)(xi)分，根據轉錄(lu)特(te)征(zheng)(zheng)的(de)(de)(de)不同定(ding)義(yi)了5種亞(ya)型(xing)（T&S1-5）（圖(tu)(tu)5a），并展示了不同亞(ya)群的(de)(de)(de)top marker基(ji)因和(he)marker基(ji)因的(de)(de)(de)GO富(fu)(fu)集結果。以STAR和(he)CYB5A表(biao)達(da)為(wei)特(te)征(zheng)(zheng)的(de)(de)(de)T&S1，表(biao)現出豐富(fu)(fu)的(de)(de)(de)RNA和(he)蛋白(bai)質(zhi)合(he)成過程（圖(tu)(tu)5b-c），并在(zai)(zai)卵巢(chao)(chao)髓質(zhi)中(zhong)(zhong)(zhong)廣泛分布(bu)（圖(tu)(tu)5d）。T&S2，表(biao)達(da)ECM相關(guan)基(ji)因，如(ru)COL1A1和(he)COL3A1，與(yu)“細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)外(wai)囊泡”和(he)“細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)外(wai)基(ji)質(zhi)”通(tong)路相關(guan)，并位于卵泡周(zhou)圍（圖(tu)(tu)5b-d）。T&S3表(biao)達(da)肌成纖(xian)維(wei)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)標記物ACTA2和(he)TAGLN，在(zai)(zai)位于血管周(zhou)圍的(de)(de)(de)超分子纖(xian)維(wei)通(tong)路和(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)骨架蛋白(bai)結合(he)通(tong)路中(zhong)(zhong)(zhong)富(fu)(fu)集（圖(tu)(tu)5b-d）。T&S4，由FBLN1和(he)CXCL2定(ding)義(yi)，位于外(wai)皮層，與(yu)“化學(xue)反(fan)應”和(he)“對(dui)刺激(ji)反(fan)應的(de)(de)(de)調節”通(tong)路相關(guan)，可(ke)能參(can)與(yu)卵巢(chao)(chao)對(dui)外(wai)部(bu)應激(ji)的(de)(de)(de)防御（圖(tu)(tu)5b-d）。亞(ya)型(xing)5，表(biao)現為(wei)表(biao)達(da)CD74、HLA-DRB1、CCL4和(he)HLA-DRA的(de)(de)(de)炎癥樣(yang)成纖(xian)維(wei)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，在(zai)(zai) “抗(kang)原(yuan)加工和(he)呈遞”和(he)“細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)對(dui)干擾素(su)-γ的(de)(de)(de)反(fan)應”等通(tong)路中(zhong)(zhong)(zhong)富(fu)(fu)集，可(ke)能參(can)與(yu)排(pai)卵后修復。空(kong)間(jian)轉錄(lu)組數據也進(jin)(jin)一步(bu)(bu)展示了間(jian)質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)不同亞(ya)群在(zai)(zai)空(kong)間(jian)分布(bu)上的(de)(de)(de)異同，并且作(zuo)者還(huan)利用T&S亞(ya)型(xing)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)標記物進(jin)(jin)行(xing)了進(jin)(jin)一步(bu)(bu)的(de)(de)(de)實驗驗證（圖(tu)(tu)5d-e）。

接下(xia)來作者通(tong)過(guo)軌(gui)跡(ji)(ji)(ji)分析研究T&S細(xi)胞(bao)亞型(xing)(xing)的(de)(de)動態轉(zhuan)換關系，發現(xian)T&S細(xi)胞(bao)的(de)(de)亞型(xing)(xing)2占(zhan)據了軌(gui)跡(ji)(ji)(ji)路徑的(de)(de)初始階段（圖5f）。此外，我們(men)還分析了不同(tong)組(zu)之間T&S細(xi)胞(bao)亞型(xing)(xing)的(de)(de)軌(gui)跡(ji)(ji)(ji)差(cha)異。值(zhi)得注意的(de)(de)是，早期的(de)(de)T&S細(xi)胞(bao)主要(yao)存在于年(nian)(nian)輕和中(zhong)年(nian)(nian)樣(yang)本中(zhong)，而老(lao)年(nian)(nian)樣(yang)本中(zhong)的(de)(de)T&S細(xi)胞(bao)主要(yao)存在于過(guo)渡路徑的(de)(de)末端，提示在衰老(lao)過(guo)程中(zhong)T&S細(xi)胞(bao)的(de)(de)類(lei)型(xing)(xing)可能發生(sheng)變化(hua)（圖5g）。

基(ji)因(yin)集(ji)合打分結果(guo)(guo)顯(xian)示在(zai)衰老(lao)過程中(zhong)(zhong)，所(suo)有T&S細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)群的(de)細(xi)胞(bao)(bao)衰老(lao)評分均有所(suo)增加（圖(tu)(tu)(tu)5h），同時(shi)衰老(lao)組(zu)中(zhong)(zhong)的(de)CDKN1A的(de)表達(da)上調（圖(tu)(tu)(tu)5i）。空(kong)轉(zhuan)數據(ju)和(he)IHC結果(guo)(guo)證實(shi)CDKN1A升高，特別是位(wei)于皮(pi)質(zhi)的(de)4亞(ya)型（圖(tu)(tu)(tu)5j，左、右(you)）。空(kong)轉(zhuan)數據(ju)的(de)進一步分析顯(xian)示，HMGA1、PIM1、CAV1等SASP相關細(xi)胞(bao)(bao)因(yin)子表達(da)顯(xian)著(zhu)升高（圖(tu)(tu)(tu)5k）。接下來作(zuo)者(zhe)又對21-47歲(sui)女性卵(luan)巢來源的(de)T&S細(xi)胞(bao)(bao)進行了檢測，結果(guo)(guo)發現(xian)，隨著(zhu)年齡(ling)22-47歲(sui)的(de)增加，與(yu)衰老(lao)相關的(de)HMGA1、PIM1、CAV1和(he)NF-κB的(de)表達(da)也逐漸升高，這(zhe)與(yu)scRNA-seq和(he)ST分析一致(圖(tu)(tu)(tu)5l)。這(zhe)些發現(xian)共同表明卵(luan)巢衰老(lao)過程中(zhong)(zhong)T&S細(xi)胞(bao)(bao)存在(zai)衰老(lao)樣特征。

圖5：T&S細胞(bao)在卵巢衰(shuai)老過(guo)程中的時空變化

上述分析(xi)已經證實細(xi)胞(bao)衰老(lao)是卵巢(chao)衰老(lao)的(de)(de)潛(qian)在因(yin)(yin)素，特別是在GC和(he)(he)T&S細(xi)胞(bao)中。作者采用(yong)(yong)單細(xi)胞(bao)調控網絡推理和(he)(he)聚類分析(xi)來鑒定GC和(he)(he)T&S細(xi)胞(bao)中的(de)(de)核心轉錄(lu)因(yin)(yin)子（TFs）。結果顯示，FOXP1、SOX4和(he)(he)FOS在兩(liang)種(zhong)細(xi)胞(bao)類型中表達均降低，可能在卵巢(chao)衰老(lao)中起關鍵作用(yong)(yong)（圖(tu)6a-b）。因(yin)(yin)此，作者使用(yong)(yong)人GC系（COV434）進行了FOXP1、SOX4和(he)(he)FOS的(de)(de)敲低，以研究它們對卵巢(chao)衰老(lao)的(de)(de)影響(xiang)（見補充數據(ju)）。

人卵(luan)巢中FOXP1的(de)表(biao)達顯示出與(yu)年(nian)齡相關(guan)的(de)hGCs和(he)pT&S的(de)下(xia)降(jiang)（圖(tu)6c）。在老(lao)(lao)(lao)年(nian)卵(luan)巢中的(de)免疫印(yin)跡和(he)IHC檢(jian)測結(jie)果證實了這(zhe)種下(xia)降(jiang)（圖(tu)6d-e）。接下(xia)來(lai)作者在COV434和(he)pT&S細胞中沉(chen)默FOXP1，發(fa)現衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)相關(guan)（SA）-β-gal染色(se)增(zeng)加（圖(tu)6f）。此外，FOXP1基因敲低(di)后，與(yu)細胞衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)和(he)DNA損(sun)傷相關(guan)的(de)蛋(dan)白(bai)表(biao)達上調（圖(tu)6g）。這(zhe)些(xie)發(fa)現表(biao)明，與(yu)年(nian)齡相關(guan)的(de)FOXP1的(de)減少(shao)和(he)衰(shuai)(shuai)老(lao)(lao)(lao)之間(jian)可能存在關(guan)聯。

圖6：FOXP1是卵巢(chao)細胞衰老的核(he)心調控因子

后續(xu)驗(yan)證結(jie)果：在GCs中敲(qiao)除FOXP1可加速卵(luan)巢衰老，喂食槲皮素可以保(bao)護中年小鼠的(de)卵(luan)巢儲備

作者后(hou)續(xu)構建了敲(qiao)除小(xiao)鼠(shu)模型，通過一(yi)系列(lie)生(sheng)理(li)生(sheng)化指標測定發(fa)現(xian)，在GCs中敲(qiao)除FOXP1可加速(su)卵巢衰老。用(yong)槲(hu)皮素治療生(sheng)殖衰老小(xiao)鼠(shu)發(fa)現(xian)槲(hu)皮素可以保護中年(nian)小(xiao)鼠(shu)的卵巢儲備（具體實驗設計和分析結果詳見圖7-8。

圖(tu)7：在GC中條(tiao)件敲除(chu)FOXP1可加(jia)速小鼠卵(luan)巢(chao)衰(shuai)老

圖8：槲皮素治療(liao)可保護中(zhong)年小鼠的(de)卵巢儲備(bei)功能

本(ben)研究(jiu)繪制了人類卵(luan)巢(chao)衰老(lao)的(de)(de)時空單(dan)細胞轉錄組圖譜，并確定調節卵(luan)巢(chao)細胞衰老(lao)的(de)(de)關(guan)鍵分子FOXP1會呈現增(zeng)齡(ling)性下降。槲皮素誘導的(de)(de)FOXP1的(de)(de)激活，有望成為(wei)延緩卵(luan)巢(chao)衰老(lao)的(de)(de)有效(xiao)治療(liao)策(ce)略(圖8n)。總之(zhi)，本(ben)研究(jiu)加深了對人類卵(luan)巢(chao)衰老(lao)過程的(de)(de)理解，為(wei)研究(jiu)潛在的(de)(de)治療(liao)干預提(ti)供了寶貴的(de)(de)資源。后續可以(yi)繼續探索FOXP1作為(wei)卵(luan)巢(chao)衰老(lao)診斷和(he)治療(liao)潛在靶點(dian)的(de)(de)有效(xiao)性。