2024-05-05
近日，復旦大學在醫學領域的《Journal of Microbiology，Immunology and Infection 》發表最新研究成果！本研究揭示了金山醫院Hv-CRKP的遺傳流行病學情況，發現Hv-CRKP ST11-KL64已迅速取代ST11-KL47，成為各醫院病房的主要流行亞型，突出了對Hv-CRKP進行全面早期監測的重要性。 本研究的(de)細菌(jun)基因(yin)組(zu)完成(cheng)圖(tu)測序由上海派森諾生(sheng)物科技股份有限(xian)公(gong)司完成(cheng)。
01、研究背景 肺炎克(ke)雷伯(bo)菌是一(yi)種條件致(zhi)病菌，可引起多(duo)種醫療獲得性感染（HAI）。與經典肺炎克(ke)雷伯(bo)菌(cKp)相比，高(gao)毒(du)力肺炎克(ke)雷伯(bo)菌(hvKp)通常會導(dao)致(zhi)危及生命的社(she)區(qu)獲得性感染(CAI)。hvKP的這種高(gao)毒(du)力表型被認(ren)為是由(you)一(yi)個(ge)毒(du)力質粒的存在引起的，該質粒包(bao)括兩個(ge)莢膜多(duo)糖(CPS)調節基因(rmpA和rmpA2)和(he)幾個鐵(tie)載體基因簇。除了hvKP外，碳青霉(mei)烯類(lei)耐(nai)藥性(xing)肺炎克雷伯菌(jun)(CRKP)的演變要(yao)同樣令人擔憂。已知CRKP最(zui)關鍵的耐(nai)藥機制之一是碳青霉(mei)烯酶的產生，包(bao)括(kuo)blaKPC、blaNDM和blaOXA-48家(jia)族。目前關(guan)于CRKP和(he)(he)(he)hvKP菌株(zhu)趨(qu)同的(de)報(bao)道(dao)正在逐(zhu)漸增加，全球各地都發現了碳青(qing)霉烯耐藥(yao)和(he)(he)(he)高(gao)毒(du)菌株(zhu)的(de)融合。Hv-CRKP具有高(gao)傳(chuan)播性、高(gao)耐藥(yao)性和(he)(he)(he)高(gao)毒(du)力，被認為是下一代的(de)超級細(xi)菌。本研究調查(cha)了2014 - 2018年上海(hai)某地方(fang)醫(yi)院Hv-CRKP株(zhu)的(de)流行病(bing)學特征(zheng)、耐藥(yao)性特征(zheng)和(he)(he)(he)關(guan)鍵毒(du)力決定(ding)因素(su)，本研究結果將為Hv-CRKP菌株(zhu)的(de)關(guan)鍵毒(du)力基因和(he)(he)(he)ARGs的(de)雜交(jiao)進化機制、全面的(de)質粒(li)譜和(he)(he)(he)有針(zhen)對性的(de)早期預(yu)警提供新(xin)的(de)見解。
02、研究材料與方法
1.實驗材料：2014年(nian)9月至2018年(nian)8月，在上海金山某醫(yi)院的不同臨床標(biao)本(ben)中收集到2579株獨特(te)的CRKP臨床分離株。 2.測序(xu)平臺：Illumina +Pacbio 3.分(fen)(fen)析(xi)內容(rong)：細菌基因組完成(cheng)圖(tu)測序(xu)、MLST分(fen)(fen)型、毒力基因分(fen)(fen)析(xi)、耐藥基因分(fen)(fen)析(xi)、血(xue)清型分(fen)(fen)析(xi)、進化樹構建(jian)以(yi)及質(zhi)粒(li)遺傳環境分(fen)(fen)析(xi)等。
03、研(yan)究結果
Hv-CRKP患者的關(guan)鍵(jian)臨(lin)床特征(zheng) 研究(jiu)了金山醫院2579例CRKP培(pei)養結(jie)果陽性(xing)(xing)的(de)患者(zhe)，通過rmpA和(he)(或(huo))rmpA基因的(de)PCR陽性(xing)(xing)結(jie)果分(fen)離出(chu)560株(zhu)Hv-CRKP，對(dui)(dui)其進行(xing)臨床特(te)征分(fen)析，發現男(nan)性(xing)(xing)患者(zhe)占(zhan)比(bi)明(ming)顯高于女性(xing)(xing)患者(zhe)占(zhan)比(bi)，且菌株(zhu)來自各(ge)種來源(yuan)。所有(you)的(de)Hv-CRKP菌株(zhu)都表(biao)現出(chu)明(ming)顯的(de)碳(tan)青(qing)霉烯(xi)類(lei)耐藥性(xing)(xing)，尤其是(shi)對(dui)(dui)美羅培(pei)南和(he)亞胺(an)培(pei)南的(de)耐藥性(xing)(xing)，所有(you)菌株(zhu)均對(dui)(dui)替加環(huan)素敏(min)感。 表(biao)1 hv-CRKP菌株的臨床特征及耐(nai)藥性分(fen)析 Hv-CRKP的分(fen)子特征(zheng) 155株(zhu)(zhu)(zhu)Hv-CRKP中(zhong)(zhong)，ST11型(xing)(xing)感染(ran)率(lv)最高且(qie)其(qi)檢出(chu)率(lv)從2014年(nian)(nian)的(de)40%穩步上(shang)升至2018年(nian)(nian)的(de)93.9%。KeO分(fen)型(xing)(xing)結果以(yi)KL64-O1/O2v1為(wei)主，其(qi)次是(shi)KL47-OL101和(he)KL24-O1/O2v1，KL64的(de)檢出(chu)率(lv)逐年(nian)(nian)攀升，而KL47的(de)檢出(chu)率(lv)逐步降為(wei)0。155株(zhu)(zhu)(zhu)Hv-CRKP中(zhong)(zhong)絕大多數含有(you)blaKPC-2，其(qi)次是(shi)blaOXA-232， blaKPC-3和(he)blaNDM-5，且(qie)所有(you)ST11菌株(zhu)(zhu)(zhu)僅(jin)攜帶blaKPC-2。Hv-CRKP分(fen)離株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)檢出(chu)blaCTX-M基因(yin)(yin)(yin)的(de)比例為(wei)85.8%，其(qi)中(zhong)(zhong)blaCTX-M-65是(shi)主要的(de)blaCTX-M基因(yin)(yin)(yin)。此(ci)外(wai)，還觀察到(dao)這些(xie)菌株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)存(cun)在(zai)較高的(de)孔蛋白(bai)缺陷。aadA2和(he)aac (3)-IId是(shi)主要的(de)氨基糖苷耐藥(yao)基因(yin)(yin)(yin)，aadA2的(de)比例從2014年(nian)(nian)的(de)20%上(shang)升到(dao)2018年(nian)(nian)的(de)90.9%。此(ci)外(wai)，63.2%的(de)分(fen)離株(zhu)(zhu)(zhu)檢出(chu)基因(yin)(yin)(yin)qnrS1，檢出(chu)率(lv)由2014年(nian)(nian)的(de)40%上(shang)升至2018年(nian)(nian)的(de)93%。研究發現(xian)sul1和(he)sul2介(jie)導的(de)磺(huang)胺耐藥(yao)性，隨著(zhu)時(shi)間的(de)推移(yi)，sul2的(de)發現(xian)頻率(lv)更高。在(zai)這些(xie)Hv-CRKP基因(yin)(yin)(yin)組中(zhong)(zhong)，鐵載體的(de)優勢度分(fen)別為(wei)100%、99.4%、12.3%和(he)5.2%，98.7%的(de)菌株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)存(cun)在(zai)rmpA2基因(yin)(yin)(yin)。 系統發育時間研究 根據時(shi)間的系(xi)(xi)統(tong)發育分析(xi)，這些菌株(zhu)分為四個(ge)(ge)初級分支1-4，在(zai)(zai)最(zui)大的Clade 3中(zhong)可以(yi)區(qu)分出(chu)亞(ya)分支3.1 - 3.4。Clade 1包括21個(ge)(ge)菌株(zhu)，Clade 2有16個(ge)(ge)菌株(zhu)，Clade3有145個(ge)(ge)菌株(zhu)，Clade4有4個(ge)(ge)菌株(zhu)。Clade 1系(xi)(xi)主要為ST15克(ke)隆，Clade 2系(xi)(xi)由多(duo)個(ge)(ge)ST克(ke)隆組(zu)成(cheng)，Clade 3系(xi)(xi)為ST11克(ke)隆，Clade 4系(xi)(xi)為ST23克(ke)隆。分析(xi)結果表明Clade 1菌株(zhu)在(zai)(zai)1981年擁有最(zui)近(jin)的共同祖先，Clade 2菌株(zhu)在(zai)(zai)1978年，Clade 3菌株(zhu)在(zai)(zai)1995年，Clade 4菌株(zhu)在(zai)(zai)2015年。 圖1臨(lin)床分離肺炎克雷伯(bo)菌的時(shi)間系統發(fa)育(yu)樹 比較基因組分(fen)析 系統發育樹由(you)三個(ge)主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)分(fen)支(zhi)組(zu)成，Clade 1和(he)(he)(he)Clade 3主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)由(you)ST11克(ke)隆組(zu)成，分(fen)別為100%和(he)(he)(he)97.8%。Clade 1參(can)考菌株主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)來自(zi)上(shang)海(hai)(hai)，Clade 3參(can)考菌株主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)來自(zi)浙江。這可能表明Clade 1 Hv-CRKP分(fen)離株僅局限于上(shang)海(hai)(hai)，而(er)Clade 3 Hv-CRKP分(fen)離株分(fen)布于上(shang)海(hai)(hai)和(he)(he)(he)浙江。Clade 2具有許多(duo)高毒性STs，包括(kuo)ST15、ST23、ST65和(he)(he)(he)ST86。Clade 3主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)攜(xie)帶KL64和(he)(he)(he)KL47，而(er)Clade 1主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)攜(xie)帶KL64。進(jin)化支(zhi)2的碳青霉烯酶多(duo)樣性高于其他兩個(ge)進(jin)化支(zhi)(主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)攜(xie)帶blaKPC-2)。blaOXA-232在(zai)(zai)進(jin)化枝(zhi)2中(zhong)被發現，但在(zai)(zai)其他進(jin)化枝(zhi)中(zhong)均不存在(zai)(zai)。blaCTX-M-65+ SHV-12主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)在(zai)(zai)Clade 1和(he)(he)(he)3中(zhong)檢(jian)測(ce)到，而(er)blaCTX-M-15主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)在(zai)(zai)Clade 2中(zhong)檢(jian)測(ce)到,fosA3基因主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)存在(zai)(zai)于Clade 1和(he)(he)(he)Clade 3。關(guan)于ybt毒力基因，Clade 1主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)攜(xie)帶ybt14-ICEKp12和(he)(he)(he)ybt1-ICEKp10，而(er)其他兩個(ge)進(jin)化枝(zhi)主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)攜(xie)帶ybt9-ICEKp3。 圖2：炎克(ke)雷(lei)伯(bo)菌基(ji)因(yin)組的系統(tong)發育分析 毒力(li)和抗性質粒的重要特征(zheng) 基(ji)(ji)因(yin)組測序(xu)得到菌株SH352、SH500和(he)SH552的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)組大小(xiao)分(fen)別為(wei)(wei)6290,840、6175,253和(he)5,983,274bp，這三個基(ji)(ji)因(yin)組有1條染色體和(he)7個質粒(li)；鑒(jian)定出一個攜帶(dai)(dai)rmpA2的(de)(de)(de)質粒(li)pSH552p1，2個攜帶(dai)(dai)blaKPC-2的(de)(de)(de)質粒(li)pSH500p2和(he)pSH552p3，1個攜帶(dai)(dai)blaNDM-1的(de)(de)(de)質粒(li)pSH352p3。pSH352p3和(he)pSH500p2均為(wei)(wei)IncFII質粒(li)。blaNDM-1周圍結構為(wei)(wei)rmtC-blaNDM-1-trpF-dsbD-cutA-grosS-groL-IS3,圍繞blaKPC-2的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)組環境表明存在兩種不同的(de)(de)(de)遺傳結構。pSH500p2的(de)(de)(de)blaKPC-2周圍結構為(wei)(wei)IS26-ISKpn6-blaKPC-2-ISKpn27-Tn3-IS26, pSH552p2為(wei)(wei)IS26-Tn3-hin-klcA-blaKPC-2-ISKpn27-Tn3-IS26,這兩種類型(xing)都是基(ji)(ji)于IS26的(de)(de)(de)復合轉座子。 圖(tu)3：攜帶blaKPC-2和blaNDM-1質粒的特性 動物感染(ran)模型 選取6株毒(du)力(li)評分(fen)不同的(de)(de)菌(jun)株進(jin)行幼蟲(chong)感(gan)染實(shi)驗，注(zhu)射(she)18 h后，高(gao)毒(du)力(li)菌(jun)株NTUH-K2044的(de)(de)死亡率(lv)(lv)為100%，略(lve)高(gao)于(yu)注(zhu)射(she)SH352和SH416的(de)(de)幼蟲(chong)。SH419、SH503、SH509和SH552組分(fen)別在18 h、72 h、18 h、48 h和48 h時達到100%的(de)(de)死亡率(lv)(lv)。其(qi)他組之間沒有統計學差異。這些結果表明，SH352和SH416的(de)(de)毒(du)力(li)低于(yu)NTUH-K2044，毒(du)力(li)評分(fen)較(jiao)高(gao)的(de)(de)菌(jun)株的(de)(de)毒(du)力(li)與NTUH-K2044相當。
04、結 論(lun)
本(ben)研究揭示了金山(shan)醫院Hv-CRKP的(de)遺傳(chuan)流(liu)行病(bing)學，在該醫院的(de)Hv-CRKP中檢(jian)測到高度的(de)基因共(gong)性(xing)，特(te)別是(shi)ST11-KL64和(he)ST11-KL47克(ke)隆，容易在整個醫院病(bing)房水平傳(chuan)播。因此，迫切需要(yao)加強對Hv-CRKP的(de)監測，部署分子和(he)基因組技術以(yi)準確和(he)快速(su)地檢(jian)測高風險并采取(qu)嚴格(ge)措施控制其在該機構的(de)進一步(bu)傳(chuan)播。
如需進一步(bu)討(tao)論(lun)，歡迎發郵(you)件或者致(zhi)電我們喲（郵(you)箱地址：microsupport@doudin.cn，聯系電話：021-80118168-8617）！
文章索引：Guo, Ming-Quan, et al. "Genomic epidemiology of hypervirulent carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae at Jinshan local hospital, Shanghai, during 2014–2018." Journal of Microbiology, Immunology and Infection 57.1 (2024): 128-137.
