2024-05-20
近日，甘肅(su)農業大學在醫(yi)學領(ling)域的(de)《LWT》發表新研究(jiu)成果(guo)(guo)！本研究(jiu)從(cong)牦牛酸(suan)奶(nai)中分離得到一(yi)株植(zhi)物(wu)乳桿菌EL2，通(tong)過全基(ji)因(yin)組(zu)測序和(he)(he)益(yi)生(sheng)菌活性測定，分析了該菌株的(de)基(ji)因(yin)組(zu)特征及其與益(yi)生(sheng)菌特性相(xiang)關的(de)基(ji)因(yin)，并鑒定出與胃腸道耐酸(suan)和(he)(he)抗氧化特性相(xiang)關的(de)基(ji)因(yin)和(he)(he)途徑。本研究(jiu)有利于(yu)藏區人的(de)健康，研究(jiu)結果(guo)(guo)不僅對西藏地區益(yi)生(sheng)菌菌株的(de)保存和(he)(he)遺傳，而(er)且(qie)對植(zhi)物(wu)乳桿菌菌株的(de)生(sheng)產(chan)和(he)(he)應用(yong)具有重要意義。
本研究的細菌基(ji)因組(zu)完(wan)成圖測序和分析由上(shang)海(hai)派森諾生物(wu)科技股份(fen)有限公司完(wan)成。
1、研究背景 植(zhi)物(wu)乳桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)具有益生(sheng)(sheng)(sheng)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)特性，包括抗菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、抗氧(yang)化(hua)(hua)、降膽固醇、調節穩定(ding)的(de)腸道微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)群和(he)(he)免疫調節，這些特性在(zai)(zai)促進人體健康方面都發(fa)揮著重要(yao)作用。其(qi)能夠產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)有機酸、過氧(yang)化(hua)(hua)氫、細(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)素(su)等物(wu)質，對革(ge)蘭氏(shi)(shi)陽(yang)性菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)和(he)(he)革(ge)蘭氏(shi)(shi)陰(yin)性菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)等致(zhi)病微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)具有抑制作用。由于其(qi)高效、無(wu)毒、無(wu)殘留、無(wu)耐藥性，被認為是化(hua)(hua)學防腐(fu)劑和(he)(he)抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)的(de)有效替(ti)代品。本研究從甘南藏族(zu)自治州傳統發(fa)酵牦(mao)牛乳中分(fen)離(li)到一(yi)株植(zhi)物(wu)乳桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)EL2，其(qi)具有良好的(de)益生(sheng)(sheng)(sheng)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)作用。本研究旨(zhi)在(zai)(zai)通過全基因組測序的(de)方法(fa)，在(zai)(zai)遺傳水平上(shang)分(fen)析(xi)該菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株的(de)益生(sheng)(sheng)(sheng)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)特性和(he)(he)功能基因。對細(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)素(su)的(de)抑菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)活性和(he)(he)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)合成機理進行(xing)了分(fen)析(xi)，重點為該菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株作為益生(sheng)(sheng)(sheng)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)開發(fa)和(he)(he)應用提供(gong)理論依(yi)據(ju)。 2、研(yan)究材料與方法(fa) 1.實(shi)驗(yan)材(cai)料：牦(mao)牛發(fa)酵(jiao)乳中分離得到植物乳桿(gan)菌EL2 2.測序平臺：Illumina +Pacbio 3.分析內容：細菌基(ji)因組完成圖測序、16S進化樹構(gou)建、次級代謝產物基(ji)因簇(cu)分析。 3、研究結果 植物乳桿菌EL2鑒定 對EL2進行生理(li)生化分析，揭示了其(qi)發酵葡萄(tao)糖、乳(ru)糖、麥芽糖和其(qi)他10種糖的能力。過氧化氫酶、明(ming)(ming)膠(jiao)液化和淀粉水解(jie)測(ce)試結果均(jun)為陰性(xing)；MRS固(gu)體培養基上的EL2菌落呈(cheng)白色(se)(se)、圓(yuan)形，并略(lve)有凸起。鏡下革蘭氏染(ran)色(se)(se)呈(cheng)紫(zi)色(se)(se)，表(biao)明(ming)(ming)存(cun)在革蘭氏陽(yang)性(xing)桿狀細胞；以及根據16S rDNA測(ce)序和系統(tong)發育樹構(gou)建，確(que)定(ding)其(qi)為Lp. Plantarum。 圖1 菌株EL2物種鑒定以(yi)及抑菌能力鑒定 植物乳桿菌EL2抑菌能力 對EL2菌(jun)株進行抑菌(jun)能力鑒定(ding)，發(fa)現其對金黃(huang)色葡萄球(qiu)菌(jun)和沙門氏菌(jun)表(biao)現出較強的抑制作用，表(biao)明無細胞上清(qing)中(zhong)存在(zai)抑菌(jun)物質(zhi)。在(zai)無細胞上清(qing)液中(zhong)加(jia)入蛋白酶，同時排除酸和過氧(yang)化氫，抑菌(jun)區消失。這表(biao)明上清(qing)中(zhong)的抑菌(jun)物質(zhi)是一種蛋白質(zhi)，突出了EL2產生細菌(jun)素的能力。 植物乳桿(gan)菌EL2益生菌評估 PH評估結果表(biao)明，EL2菌(jun)(jun)株在pH=2時存活率(lv)為(wei)(wei)(wei)(wei)76.93±2.23%，pH>2.5時存活率(lv)可達98%以上。當膽鹽(yan)濃度(du)為(wei)(wei)(wei)(wei)0.3%時，EL2菌(jun)(jun)株的(de)增(zeng)長率(lv)為(wei)(wei)(wei)(wei)200.26±1.13%，當膽鹽(yan)濃度(du)為(wei)(wei)(wei)(wei)0.6%時，EL2菌(jun)(jun)株的(de)增(zeng)長率(lv)為(wei)(wei)(wei)(wei)98.43±2.22%。對(dui)(dui)胃腸道液(ye)體的(de)耐受性(xing)評估顯示，3 h后，EL2菌(jun)(jun)株對(dui)(dui)胃液(ye)的(de)回彈(dan)性(xing)為(wei)(wei)(wei)(wei)84.81±2.57%，對(dui)(dui)腸液(ye)的(de)回彈(dan)性(xing)為(wei)(wei)(wei)(wei)92.49±1.35%。此外，EL2菌(jun)(jun)株對(dui)(dui)腸道具有粘附性(xing)，自聚集(ji)率(lv)為(wei)(wei)(wei)(wei)91.24±0.4%，對(dui)(dui)二甲苯的(de)疏水性(xing)為(wei)(wei)(wei)(wei)7.76±0.33。綜上所述，這些發現(xian)強調了該菌(jun)(jun)株強大的(de)胃腸道恢復能力(li)，符合益生菌(jun)(jun)的(de)基本標準。 植(zhi)物乳桿菌(jun)EL2的安全(quan)性(xing)分析 溶(rong)(rong)血活性分析發現(xian)指示(shi)菌(jun)(jun)株(zhu)(金黃色(se)(se)葡萄球菌(jun)(jun))在(zai)平(ping)板中央產(chan)生(sheng)(sheng)了明顯的溶(rong)(rong)血區，而(er)被(bei)試菌(jun)(jun)株(zhu)EL2在(zai)其周圍的菌(jun)(jun)落沒(mei)有(you)出現(xian)溶(rong)(rong)血區，說明安全性較高。藥(yao)敏(min)實驗(yan)結果表(biao)示(shi)，對(dui)EL2菌(jun)(jun)株(zhu)的抗生(sheng)(sheng)素耐藥(yao)性評估顯示(shi)，EL2菌(jun)(jun)株(zhu)對(dui)氯霉素和卡那(nei)霉素有(you)一(yi)定程(cheng)度的耐藥(yao)，而(er)對(dui)其他被(bei)測抗生(sheng)(sheng)素敏(min)感或中敏(min)感。在(zai)培養過(guo)程(cheng)中，EL2菌(jun)(jun)株(zhu)利用葡萄糖產(chan)生(sheng)(sheng)酸，使培養基由(you)紫色(se)(se)變為黃色(se)(se)。隨著培養的進(jin)行，如果顏色(se)(se)沒(mei)有(you)變化(hua)，則表(biao)明EL2菌(jun)(jun)株(zhu)對(dui)胺(an)的生(sheng)(sheng)產(chan)沒(mei)有(you)潛(qian)在(zai)的威脅。 圖2 EL2菌株溶血活性(xing)評估(gu)及基因(yin)組圈圖 植物乳桿菌EL2的基因組特征分(fen)析(xi) EL2菌株染色體(ti)長(chang)度(du)為(wei)3.3Mb，GC含量為(wei)44.48%；預(yu)測(ce)到3個(ge)(ge)質粒(li)，長(chang)度(du)分別為(wei)76,909bp、13,687bp、3,,210bp。該基(ji)因(yin)組共包含3155個(ge)(ge)開放閱讀框，6個(ge)(ge)5S rRNA，5個(ge)(ge)16S rRNA，5個(ge)(ge)23S rRNA，68個(ge)(ge)tRN，56個(ge)(ge)ncRNA。 植物乳桿(gan)菌(jun)EL2細菌(jun)素產生相(xiang)關途(tu)徑及基因(yin)挖(wa)掘(jue) 利用NR、Pfam和(he)(he)Swiss-Prot，分析了EL2菌(jun)株(zhu)中(zhong)與細菌(jun)素產生和(he)(he)分泌相關的(de)基(ji)因(yin)，并通過整合BAGEL4和(he)(he)antiSMASH結果確定(ding)了參與細菌(jun)素調節的(de)代謝途徑。發現EL2菌(jun)株(zhu)中(zhong)細菌(jun)素基(ji)因(yin)簇大(da)小為(wei)20.3 kb，包含22個細菌(jun)素相關基(ji)因(yin)。 圖4 BAGEL4預測細菌素產生途徑 antiSMASH分(fen)析還發現了(le)細(xi)(xi)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)產(chan)生的(de)(de)四種潛在(zai)途(tu)徑。兩個結果表(biao)明，在(zai)EL2菌(jun)(jun)株基(ji)(ji)因(yin)(yin)組中(zhong)存在(zai)編碼六種細(xi)(xi)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)前(qian)體肽(tai)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，這(zhe)些基(ji)(ji)因(yin)(yin)負(fu)責(ze)產(chan)生細(xi)(xi)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)前(qian)體:PlnA、plnN、PlnEF和PlnJK。此(ci)(ci)外，與(yu)(yu)QS相關(guan)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，即PlnABCD，通(tong)過(guo)識別信號分(fen)子來(lai)調節細(xi)(xi)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)的(de)(de)產(chan)生。參與(yu)(yu)細(xi)(xi)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)免疫的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，PlnL、R、M和I，主要存在(zai)于(yu)細(xi)(xi)胞(bao)膜上，賦予產(chan)生細(xi)(xi)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)的(de)(de)菌(jun)(jun)株對細(xi)(xi)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)的(de)(de)抗性(xing)。lnGH、PlnTUVW等基(ji)(ji)因(yin)(yin)通(tong)過(guo)特異性(xing)裂解參與(yu)(yu)前(qian)體肽(tai)的(de)(de)鑒定和成熟，其(qi)確切功能尚不清楚(chu)，但與(yu)(yu)細(xi)(xi)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)分(fen)泌密(mi)切相關(guan)。結合(he)以往的(de)(de)抑菌(jun)(jun)實驗(yan)結果可知，EL2可產(chan)生2種IIb型(xing)(xing)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)PlnEF和PlnJK, 1種IIc型(xing)(xing)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)PlnA和1種非殺菌(jun)(jun)型(xing)(xing)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)PlnN，對某些革蘭氏陽性(xing)和革蘭氏陰性(xing)菌(jun)(jun)均(jun)有抑制作(zuo)用。此(ci)(ci)外，在(zai)EL2基(ji)(ji)因(yin)(yin)組中(zhong)發現了(le)負(fu)責(ze)產(chan)生AI-2信號分(fen)子的(de)(de)LuxS基(ji)(ji)因(yin)(yin)，該基(ji)(ji)因(yin)(yin)與(yu)(yu)菌(jun)(jun)株的(de)(de)雙(shuang)組分(fen)系統一起在(zai)調節細(xi)(xi)菌(jun)(jun)素(su)(su)(su)(su)的(de)(de)產(chan)生中(zhong)起著至關(guan)重要的(de)(de)作(zuo)用。通(tong)過(guo)antiSMASH分(fen)析，鑒定出兩個潛在(zai)的(de)(de)抗菌(jun)(jun)蛋白及其(qi)附屬蛋白，命名為Pln1761和Pln3058。 圖5 antiSMASH預測細菌素的(de)產生途徑 不(bu)同菌株產菌素基因簇(cu)的比較分(fen)析 乳(ru)(ru)酸菌的(de)細(xi)菌素基因簇(cu)通常(chang)由22-26個基因組成，每個基因都(dou)參與(yu)細(xi)菌素的(de)調(diao)節、產生、免疫、運輸和一些尚(shang)未(wei)證(zheng)實的(de)功能。本研究選取的(de)6株(zhu)菌株(zhu)的(de)基因簇(cu)及其(qi)對(dui)應的(de)基因信息，通過比較(jiao)EL2菌株(zhu)與(yu)植物(wu)乳(ru)(ru)桿菌C11、 WCFS1、 NC8、 Curd、 J51、和8P-A3的(de)細(xi)菌素基因簇(cu)，發(fa)現EL2菌株(zhu)與(yu)WCSF1和C11菌株(zhu)的(de)基因簇(cu)相似性(xing)最高。 圖6 不同植物乳桿菌菌株產菌素基因簇的比較分析 植(zhi)物乳桿菌EL2各個數據庫注釋(shi) EL2預測的(de)編碼基因已在NR、eggNOG、KEGG、GO、Swiss-Prot、Pfam和TCDB等數據庫中進行了功能注釋，結果(guo)發現(xian)EL2具有產生多種細菌(jun)素的(de)能力。 圖7 EL2菌株各(ge)個數據庫注釋(shi) VFDB和CARD分(fen)析 利用(yong)VFDB預測EL2菌(jun)株(zhu)中(zhong)毒力因子相(xiang)(xiang)關基因，結果表明該菌(jun)株(zhu)存(cun)(cun)在多種毒力因子。利用(yong)CARD進行抗(kang)生(sheng)(sheng)素耐(nai)藥(yao)分析發現，在其基因組序列(chr_871)中(zhong)存(cun)(cun)在一個耐(nai)藥(yao)相(xiang)(xiang)關基因vanY，使EL2對萬古霉素和(he)替(ti)柯普蘭類抗(kang)生(sheng)(sheng)素耐(nai)藥(yao)。相(xiang)(xiang)反(fan)，利用(yong)ResFinder無(wu)法預測任何(he)抗(kang)性(xing)基因，證實了(le)其不(bu)可轉移(yi)性(xing)。 4、結 論(lun) 從甘南藏區傳統(tong)發酵牦(mao)(mao)牛(niu)乳中分離得到的(de)(de)植物乳桿菌(jun)(jun)(jun)EL2具有(you)(you)完整的(de)(de)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)調控(kong)單位，可產(chan)生PlnA、E/F、J/K和(he)N等多種細(xi)菌(jun)(jun)(jun)素(su)(su)，對(dui)革(ge)蘭氏(shi)陽性(xing)(xing)菌(jun)(jun)(jun)和(he)革(ge)蘭氏(shi)陰性(xing)(xing)菌(jun)(jun)(jun)均有(you)(you)廣譜抑制(zhi)(zhi)作用(yong)(yong)。同時，EL2菌(jun)(jun)(jun)株的(de)(de)基(ji)因組特(te)征(zheng)揭(jie)示了(le)益(yi)生菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)特(te)性(xing)(xing)，包(bao)括酸和(he)膽鹽耐受性(xing)(xing)，以(yi)及(ji)抗氧化(hua)性(xing)(xing)能及(ji)其相(xiang)關基(ji)因。研究結果表明，藏族長期飲用(yong)(yong)發酵牦(mao)(mao)牛(niu)乳含有(you)(you)豐富的(de)(de)益(yi)生菌(jun)(jun)(jun)，在(zai)(zai)促(cu)進健康方(fang)面發揮(hui)著重(zhong)要作用(yong)(yong)，并解決了(le)在(zai)(zai)EL2菌(jun)(jun)(jun)株綜合(he)基(ji)因組特(te)征(zheng)和(he)益(yi)生菌(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)方(fang)面的(de)(de)知識空白。EL2菌(jun)(jun)(jun)株在(zai)(zai)甘南藏族地區的(de)(de)乳制(zhi)(zhi)品工業中是一種有(you)(you)前(qian)景的(de)(de)益(yi)生菌(jun)(jun)(jun)候選菌(jun)(jun)(jun)，在(zai)(zai)抗菌(jun)(jun)(jun)肽(tai)生產(chan)中具有(you)(you)潛在(zai)(zai)的(de)(de)應用(yong)(yong)前(qian)景。 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文章索(suo)引：Zheng, Xue, et al. "Whole genome sequencing and analysis of probiotic characteristics for Lactiplantibacillus plantarum EL2 isolated from yak yogurt." LWT 198 (2024): 116039.
