2024-05-20
文章(zhang)題目：Breaking Iron Homeostasis: Iron Capturing Nanocomposites for Combating Bacterial Biofilm
技術手(shou)段：RNA-seq等
吉(ji)林(lin)大學研(yan)究(jiu)小組開發了一種新的抗(kang)菌(jun)策略，通過納(na)米(mi)復合材料靶向細(xi)菌(jun)鐵攝入并使(shi)其饑餓。為(wei)細(xi)菌(jun)感染(ran)的治療提供(gong)了一種全面的解(jie)決方案。研(yan)究(jiu)結(jie)果發表在《Angewandte Chemie International Edition》上。本研(yan)究(jiu)中轉(zhuan)錄組測序及(ji)部分分析(xi)工作由上海派森諾生(sheng)物科技股份有(you)限公(gong)司完成。
名詞解釋 INIT：鐵營養(yang)免(mian)疫療法 Ga-CT：Ga/Cu-TCPP，鎵，銅(tong)摻雜四(si)（4-羧(suo)基苯(ben)基）卟啉金屬 MOF:金屬有機(ji)框架 PAMAM PDs：多胺-胺聚(ju)合(he)物(wu)點 NCs/NSs：納米復合材(cai)料/納米片 PDT：光動力(li)療法 PTT：光熱治(zhi)療法(fa) DFT：密度泛函理論 DEG：差異表(biao)達基因(yin) OMR：外膜(mo)受體 PBP：周質結合蛋白 ATP：三磷酸腺苷
研究(jiu)背景 細(xi)菌(jun)感(gan)染是當(dang)前(qian)最具挑(tiao)戰性(xing)(xing)的(de)問題之一(yi)，也是臨床感(gan)染性(xing)(xing)死(si)亡的(de)主要原因(yin)。細(xi)菌(jun)感(gan)染后(hou)，宿(su)主會限制(zhi)鐵(tie)離(li)子，導致一(yi)種(zhong)被稱(cheng)為營養免(mian)疫的(de)現象。在(zai)與宿(su)主共同進化(hua)(hua)后(hou)，細(xi)菌(jun)發(fa)展(zhan)出了適應(ying)途(tu)徑，如氯(lv)化(hua)(hua)血紅素攝(she)取系統，以避免(mian)缺鐵(tie)。鐵(tie)競爭發(fa)生(sheng)在(zai)感(gan)染的(de)所有(you)階段，長期(qi)控制(zhi)快速生(sheng)長的(de)細(xi)菌(jun)對(dui)宿(su)主來說是具有(you)挑(tiao)戰性(xing)(xing)的(de)。因(yin)此，開發(fa)一(yi)種(zhong)新的(de)策略來應(ying)對(dui)鐵(tie)捕獲細(xi)菌(jun)的(de)進化(hua)(hua)對(dui)抗菌(jun)營養免(mian)疫治療至關重要。 受此(ci)啟(qi)發，本文提(ti)(ti)出了一(yi)種鐵營養性(xing)免疫療法(fa)（INIT）的新策略(lve)(lve)，利用鎵（Ga），銅（Cu）摻雜四(si)（4-羧基苯基）卟啉（TCPP）金屬有機框架（MOFs）和(he)多(duo)胺-胺聚合物點（PAMAM PDs）構建的Ga-CT@P納米復(fu)合材料(liao)（NCs）來靶向細菌(jun)鐵攝(she)入并使其饑餓。最終(zhong)促進(jin)生物膜根除(chu)和(he)組織修復(fu)。本研究從營養學角度提(ti)(ti)出了一(yi)種創(chuang)新的抗菌(jun)策略(lve)(lve)，為難治性(xing)細菌(jun)感(gan)染的治療及其未來的臨床應用提(ti)(ti)供了啟(qi)示。
技術(shu)路線
研(yan)究(jiu)內容(rong) 1、Ga-CT和Ga-CT@P的合成與表(biao)征 采用(yong)溶劑熱法成(cheng)(cheng)功(gong)地制備了(le)超(chao)薄Ga-CT@P NCs（圖(tu)1a）。其(qi)中(zhong)Ga-CT NSs表(biao)現出(chu)典型的(de)(de)二維形(xing)態(tai)，PAMAM PDs分布在2D Ga-CT NSs上。雖(sui)然(ran) Ga3+和(he)Cu2+同(tong)時被引入到(dao)結(jie)構(gou)(gou)中(zhong)，但分析表(biao)明它們在結(jie)構(gou)(gou)中(zhong)占有(you)不同(tong)的(de)(de)位置。具體來說，Cu2+組裝(zhuang)成(cheng)(cheng)二維MOF結(jie)構(gou)(gou)，作為連接體，而Ga3+整合(he)到(dao)卟(bu)啉環中(zhong)，形(xing)成(cheng)(cheng)Ga-CT NCs。因(yin)此(ci)，利(li)用(yong)簡單(dan)的(de)(de)材料(liao)及其(qi)有(you)效的(de)(de)組合(he)來實(shi)現了(le)載流(liu)子(zi)的(de)(de)形(xing)成(cheng)(cheng)和(he)有(you)效的(de)(de)離子(zi)負(fu)載。 圖1 CT、Ga-CT和(he)Ga-CT@P NCs的表(biao)征 2、體外光(guang)熱、光(guang)動(dong)力學(xue)和發光(guang)活性 Ga-CT@P NCs的PDT、PTT和發光活性如圖2a所示。在光照(zhao)射下，通過(guo)分子(zi)熱運動證明了Ga-CT@P中Ga3+的有效釋放。帶正電的PAMAM PDs可以賦予Ga-CT@P與帶負(fu)電的細(xi)(xi)菌(jun)進行靜電相互(hu)作用(yong)(yong)的能力，為Ga-CT@P靠近細(xi)(xi)菌(jun)提供(gong)動力。Ga-CT@P具(ju)有協同PDT/PTT和短期抗菌(jun)作用(yong)(yong)。對(dui)于剩(sheng)余的難(nan)降解細(xi)(xi)菌(jun)，卟啉環(huan)將Ga3+提供(gong)到細(xi)(xi)菌(jun)表面，并從細(xi)(xi)菌(jun)附近去除(chu)Fe3+，導致長期的鐵饑餓和死亡。 圖2 光(guang)熱、光(guang)動力和(he)Fe3+傳感效應的評價 3、體(ti)外抗菌活性測(ce)定 用(yong)500μgmL-1的NCs處(chu)理大(da)腸(chang)桿菌(jun)（ATCC 47076）和金(jin)黃(huang)色葡萄球(qiu)(qiu)菌(jun)（ATCC 29213）的生物膜，然(ran)后(hou)用(yong)激光照(zhao)(zhao)射(she)（L）進一(yi)步處(chu)理。圖3a顯(xian)示(shi)與對(dui)照(zhao)(zhao)組相(xiang)比，所有(you)實驗組在照(zhao)(zhao)射(she)下的大(da)腸(chang)桿菌(jun)和金(jin)黃(huang)色葡萄球(qiu)(qiu)菌(jun)菌(jun)落數顯(xian)著減少。含有(you)PAMAM PDs的Ga-CT@P+L組對(dui)大(da)腸(chang)桿菌(jun)和金(jin)黃(huang)色葡萄球(qiu)(qiu)菌(jun)表現(xian)出最(zui)強的抗生素膜作用(yong)，與對(dui)照(zhao)(zhao)組相(xiang)比減少了約(yue)3倍(bei)。活體染色和掃描電鏡和SEM圖像顯(xian)示(shi)Ga-CT@P+L組中的細(xi)菌(jun)最(zui)少。 圖3 Ga-CT@P NCs的(de)抗生膜特性 4、Ga3+-腸(chang)桿菌素的密度泛函理論計算(suan) 當面臨(lin)缺鐵(tie)困(kun)境(jing)時(shi)，大腸桿(gan)菌(jun)(jun)進化分泌腸桿(gan)菌(jun)(jun)素(su)(su)。利用DFT計算研究Ga3+和Fe3+之間的(de)鐵(tie)載體結(jie)合競(jing)爭（圖4）。腸桿(gan)菌(jun)(jun)素(su)(su)與Ga3+形成的(de)配(pei)位鍵(jian)長(chang)度更均(jun)勻，結(jie)合能更大。此外，Ga3+-腸桿(gan)菌(jun)(jun)素(su)(su)比Fe3+-腸桿(gan)菌(jun)(jun)素(su)(su)更穩(wen)定(ding)。設計的(de)Ga-CT@P NCs可以通過卟啉環內(nei)的(de)Ga3+/Fe3+交(jiao)換來靶向細菌(jun)(jun)鐵(tie)營養代謝。在缺鐵(tie)條件下，Ga3+與Fe3+競(jing)爭大腸桿(gan)菌(jun)(jun)分泌的(de)腸桿(gan)菌(jun)(jun)素(su)(su)表現出極大的(de)優勢(shi)。 圖4 DFT計算結果總(zong)結 5、Ga-CT@P通過INIT靶向鐵穩態 采用RNA-seq技術對Ga-CT@P+L處理過(guo)的(de)(de)(de)(de)大腸桿菌(jun)的(de)(de)(de)(de)DEGs進行分(fen)析。PPI網(wang)絡顯示（圖5b），DEGs在(zai)三種途徑中(zhong)密切富(fu)集(ji):TCA循(xun)環(huan)、鐵(tie)硫簇代(dai)謝和TCA循(xun)環(huan)。GO富(fu)集(ji)分(fen)析（圖5c和5d）揭示了與(yu)菌(jun)毛(mao)組織相關(guan)的(de)(de)(de)(de)DEGs上調(diao)，特別是與(yu)鐵(tie)饑(ji)餓(e)反(fan)應有關(guan)的(de)(de)(de)(de)傳感器調(diao)節蛋白。與(yu)鐵(tie)硫簇代(dai)謝、TCA循(xun)環(huan)和ATP結合(he)盒（ABC）轉運(yun)體(ti)相關(guan)的(de)(de)(de)(de)DEGs下調(diao)。KEGG富(fu)集(ji)分(fen)析（圖5e和5f）顯示，與(yu)TCA循(xun)環(huan)相關(guan)的(de)(de)(de)(de)DEGs下調(diao)，而與(yu)糖酵(jiao)解相關(guan)的(de)(de)(de)(de)DEGs上調(diao)。 許多DEGs與(yu)(yu)細菌(jun)鐵代(dai)謝有關(guan)（圖5）。與(yu)(yu)鐵攝取（exbB、exbD、tonB和fepA）、運輸（feoB和efeO）相(xiang)關(guan)的基因顯(xian)(xian)(xian)著(zhu)下(xia)調。相(xiang)反，與(yu)(yu)鐵儲存相(xiang)關(guan)的基因（ftnA、nfuA和fur）顯(xian)(xian)(xian)著(zhu)上(shang)調。這些結果(guo)表明，Ga-CT@P鐵阻斷處理(li)后，細菌(jun)生(sheng)物膜中的鐵利用顯(xian)(xian)(xian)著(zhu)下(xia)調。Ga-CT@P處理(li)后，DEGs（如pgi、pfk、fba和gapA）顯(xian)(xian)(xian)著(zhu)上(shang)調，與(yu)(yu)鐵饑餓時糖酵(jiao)解的全體性上(shang)調一致(zhi)。此(ci)外，結果(guo)表明乳(ru)酸代(dai)謝途(tu)徑(jing)和丙(bing)酮酸途(tu)徑(jing)DEGs分(fen)別增加和減少。Ga-CT@P+L組(zu)乳(ru)酸產量高于對照組(zu)，導致(zhi)細菌(jun)糖代(dai)謝紊(wen)亂。 Ga-CT@P誘(you)導(dao)的(de)(de)(de)INIT的(de)(de)(de)確(que)切機制(zhi)如(ru)圖5i所示。在革蘭氏陰(yin)性(xing)菌(jun)中(zhong)(zhong)，釋放的(de)(de)(de)Ga3+與(yu)(yu)(yu)Fe3+競爭，與(yu)(yu)(yu)無鐵(tie)(tie)(tie)(tie)的(de)(de)(de)鐵(tie)(tie)(tie)(tie)載(zai)(zai)體(ti)結合，形成Ga3+-鐵(tie)(tie)(tie)(tie)載(zai)(zai)體(ti)復(fu)(fu)合物(wu)。Ga3+-鐵(tie)(tie)(tie)(tie)載(zai)(zai)體(ti)復(fu)(fu)合物(wu)被(bei)OMR、PBP和(he)內(nei)膜(mo)(mo)(mo)ATP結合盒(he)（ABC）轉運蛋白內(nei)化(hua)。TonB系統由(you)TonB, ExbB和(he)ExbD蛋白組成，將細(xi)(xi)胞質(zhi)膜(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)質(zhi)子動(dong)(dong)力與(yu)(yu)(yu)外(wai)膜(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)質(zhi)子動(dong)(dong)力偶聯，為該過程提供所需的(de)(de)(de)能量。TonB跨越(yue)細(xi)(xi)胞質(zhi)和(he)外(wai)膜(mo)(mo)(mo)之間(jian)的(de)(de)(de)質(zhi)周空間(jian)，并(bing)與(yu)(yu)(yu)與(yu)(yu)(yu)Ga3+-鐵(tie)(tie)(tie)(tie)載(zai)(zai)體(ti)結合的(de)(de)(de)OMR相互作(zuo)(zuo)用(yong)。這種相互作(zuo)(zuo)用(yong)誘(you)導(dao)TonB的(de)(de)(de)構象變化(hua)，并(bing)將其(qi)傳(chuan)遞給細(xi)(xi)胞質(zhi)膜(mo)(mo)(mo)定(ding)位的(de)(de)(de)ExbB和(he)ExbD蛋白。這種構象改變從質(zhi)子動(dong)(dong)力中(zhong)(zhong)釋放能量，從而促進了Ga3+-鐵(tie)(tie)(tie)(tie)載(zai)(zai)體(ti)復(fu)(fu)合物(wu)進入(ru)細(xi)(xi)菌(jun)細(xi)(xi)胞。一旦Ga3+-鐵(tie)(tie)(tie)(tie)載(zai)(zai)體(ti)被(bei)細(xi)(xi)胞吸收，Ga3+-鐵(tie)(tie)(tie)(tie)載(zai)(zai)體(ti)就可以(yi)作(zuo)(zuo)為Fe3+模(mo)擬物(wu)與(yu)(yu)(yu)需鐵(tie)(tie)(tie)(tie)酶(mei)結合。在氧化(hua)還原(yuan)循(xun)環中(zhong)(zhong)，Ga3+不能替代Fe3+。因此，用(yong)Ga-CT@P NCs處(chu)理(li)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)菌(jun)表(biao)現出缺(que)鐵(tie)(tie)(tie)(tie)狀態，破壞鐵(tie)(tie)(tie)(tie)代謝(xie)、鐵(tie)(tie)(tie)(tie)硫簇生物(wu)合成和(he)TCA循(xun)環。 圖5 Ga-CT@P處理大(da)腸桿(gan)菌的RNA序(xu)列(lie)分析(xi) 6、體內抗菌(jun)活(huo)性測定 利用大腸(chang)桿菌(jun)感(gan)染(ran)小鼠皮膚傷口(kou)模型(xing)，探索Ga-CT@P NCs在體內的(de)抗(kang)(kang)菌(jun)能(neng)力(li)（圖6）。Ga-CT@P+L組連(lian)續使用Ga-CT@P NCs治療后，感(gan)染(ran)創面(mian)迅速修復，幾乎完全消失。Ga-CT@P+L組炎(yan)癥(zheng)細胞(bao)數量(liang)最少(shao)，促炎(yan)因(yin)子(zi)IL-1β表(biao)達降低(di)，抗(kang)(kang)炎(yan)細胞(bao)因(yin)子(zi)Arg1水平升高。總體而言(yan)，Ga-CT@P NCs具有強(qiang)大的(de)抗(kang)(kang)菌(jun)能(neng)力(li)，通過協(xie)同PDT/PTT/INIT修復感(gan)染(ran)創面(mian)，抵抗(kang)(kang)細菌(jun)侵襲(xi)，抑(yi)制炎(yan)癥(zheng)反應，加速膠原沉積，導致感(gan)染(ran)耗散(san)和再生恢復。 圖(tu)6 Ga-CT@P NCs在(zai)體內消(xiao)除傷口感染 7、Ga-CT@P生物安全試(shi)驗 利用(yong)CCK8測(ce)定和(he)主(zhu)要器官的(de)H&E組織(zhi)學分析評估細(xi)胞毒性(xing)(xing)，結果(guo)表(biao)明(ming)，Ga-CT@P NCs（500μgmL-1）符合細(xi)胞毒性(xing)(xing)要求。利用(yong)體內(nei)熒光成(cheng)像技術評價Ga-CT@P的(de)代(dai)(dai)謝，結果(guo)表(biao)明(ming)Ga-CT@P NCs主(zhu)要通過肝臟(zang)代(dai)(dai)謝，小部分通過腎臟(zang)代(dai)(dai)謝。這(zhe)些結果(guo)表(biao)明(ming)Ga-CT@P NCs具有良好的(de)生(sheng)物安全(quan)性(xing)(xing)，在臨床治療中具有進一(yi)步應用(yong)的(de)前景。
研究結論 在這項(xiang)研究中(zhong)(zhong)，成(cheng)(cheng)功(gong)地合(he)成(cheng)(cheng)了新(xin)的(de)(de)(de)(de)Ga-CT@P NCs用于抗菌(jun)感染和(he)生物膜(mo)的(de)(de)(de)(de)形(xing)成(cheng)(cheng)。結果證(zheng)實Ga-CT@P NCs通(tong)過(guo)協同(tong)光(guang)熱(re)/光(guang)動(dong)(dong)力/鐵(tie)營(ying)養免疫治(zhi)療(liao)(liao)成(cheng)(cheng)功(gong)對抗生物膜(mo)感染并靶向細(xi)(xi)(xi)菌(jun)鐵(tie)營(ying)養代(dai)(dai)謝(xie)(xie)。首(shou)先，Ga-CT@P NCs利用帶正電的(de)(de)(de)(de)PAMAM PDs在帶負電荷的(de)(de)(de)(de)表面(mian)捕獲(huo)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)。它們具有(you)顯(xian)著(zhu)的(de)(de)(de)(de)協同(tong)光(guang)熱(re)和(he)光(guang)動(dong)(dong)力能力。然后(hou)，結合(he)了Ga3+的(de)(de)(de)(de)卟啉(lin)在照射后(hou)釋放出Ga3+離子，欺騙細(xi)(xi)(xi)菌(jun)吸(xi)收，通(tong)過(guo)卟啉(lin)環(huan)(huan)從周(zhou)圍(wei)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)環(huan)(huan)境中(zhong)(zhong)提取Fe3+離子。這種(zhong)策略(lve)使細(xi)(xi)(xi)菌(jun)處于缺鐵(tie)的(de)(de)(de)(de)環(huan)(huan)境中(zhong)(zhong)，并使它們餓死(si)，這被稱為鐵(tie)營(ying)養免疫療(liao)(liao)法(fa)。同(tong)時，所設(she)計的(de)(de)(de)(de)Ga-CT@P NCs中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)PAMAM PDs可作為監測細(xi)(xi)(xi)菌(jun)中(zhong)(zhong)動(dong)(dong)態鐵(tie)限制的(de)(de)(de)(de)監測器。進一(yi)步從轉錄組水平研究了其抑菌(jun)機制。INIT策略(lve)有(you)助于破(po)壞鐵(tie)硫(liu)簇代(dai)(dai)謝(xie)(xie)、TCA循(xun)環(huan)(huan)和(he)ATP代(dai)(dai)謝(xie)(xie)。總之，Ga-CT@P所體現的(de)(de)(de)(de)INIT策略(lve)為未(wei)來(lai)通(tong)過(guo)破(po)壞細(xi)(xi)(xi)菌(jun)營(ying)養穩態來(lai)治(zhi)療(liao)(liao)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)感染提供了新(xin)的(de)(de)(de)(de)視角。 方案：Ga-CT@P NCs的形成(左)和抗(kang)菌機(ji)制(右)示(shi)意圖
文章鏈接 DOI：//doi.org/10.1002/anie.202319690
參考(kao)文(wen)獻 Sun, Wenyue, et al. "Breaking Iron Homeostasis: Iron Capturing Nanocomposites for Combating Bacterial Biofilm." Angewandte Chemie International Edition （2024）: e202319690.
