2024-06-03
天津科技(ji)大學張翠英教授團隊在(zai)國際食(shi)品Top期(qi)刊(kan)《Food Research International》發(fa)表(biao)(biao)(biao)新科研成果(guo)。通過研究傳統高(gao)溫大曲(qu)（HTD-T）和機(ji)械(xie)高(gao)溫大曲(qu)（HTD-M）在(zai)發(fa)酵參數、酶(mei)學特性、微(wei)(wei)生(sheng)物組裝(zhuang)和演替模式、代謝(xie)表(biao)(biao)(biao)型等(deng)方面的(de)差異，結合相關(guan)性分析和功能預測(ce)，發(fa)現(xian)機(ji)械(xie)大曲(qu)峰溫滯后影響了(le)初期(qi)細菌群(qun)落組裝(zhuang)模式，且HTD-T和HTD-M代謝(xie)通路不同，確(que)定(ding)了(le)造成HTD-T和HTD-M大曲(qu)代謝(xie)表(biao)(biao)(biao)型差異的(de)核心物種，以及HTD特征風味微(wei)(wei)生(sheng)物代謝(xie)的(de)關(guan)鍵正向(xiang)驅動因素(su)，揭(jie)示了(le)HTD-T和HTD-M之間發(fa)酵異質性機(ji)制(zhi)，為優化和改進現(xian)代機(ji)械(xie)化HTD生(sheng)產提供了(le)新的(de)思(si)路。
派森諾提供(gong)了微(wei)(wei)生物多樣(yang)性測(ce)序和部分分析服務(wu)~
PART 1、研究背景(jing)
大曲(qu)(qu)是白(bai)酒釀造的(de)(de)重(zhong)要(yao)(yao)發酵(jiao)(jiao)劑，長期(qi)以來(lai)一直是白(bai)酒釀造的(de)(de)核(he)心(xin)紐帶。高溫大曲(qu)(qu)（HTD）的(de)(de)糖化(hua)力(li)和發酵(jiao)(jiao)能力(li)明顯弱于其他大曲(qu)(qu)，因(yin)此要(yao)(yao)求(qiu)其在醬香型白(bai)酒釀造過程中更高的(de)(de)投入(ru)比(bi)例（~100%），對(dui)醬香型白(bai)酒的(de)(de)香氣形成具(ju)有重(zhong)要(yao)(yao)貢獻作用。隨著科技進步，機(ji)(ji)(ji)械工(gong)藝在大型HTD企業中得(de)到(dao)了廣泛應用，但(dan)機(ji)(ji)(ji)械工(gong)藝生產的(de)(de)HTD與傳統工(gong)藝生產的(de)(de)HTD質(zhi)量存在差異(yi)。然而，現有研究(jiu)(jiu)對(dui)這一現象背(bei)后的(de)(de)機(ji)(ji)(ji)制理解暫不清晰。因(yin)此深入(ru)探究(jiu)(jiu)HTD-T和HTD-M發酵(jiao)(jiao)異(yi)質(zhi)性機(ji)(ji)(ji)制，確(que)定影響HTD質(zhi)量的(de)(de)關鍵因(yin)素，并制定HTD-M高品質(zhi)生產新策略至關重(zhong)要(yao)(yao)。
PART 2、實(shi)驗設計
1.目的(de)(de)(de)：以發酵(jiao)不同階段的(de)(de)(de)機(ji)械(xie)大(da)曲(qu)和傳(chuan)統大(da)曲(qu)作(zuo)為研究對象，通過監測大(da)曲(qu)中(zhong)細菌和真菌動(dong)態變化以及代謝(xie)產物(wu)(wu)，探究微(wei)生物(wu)(wu)與靶(ba)標代謝(xie)物(wu)(wu)、微(wei)生物(wu)(wu)與理化因子之間的(de)(de)(de)相關性，從而確定導致機(ji)械(xie)大(da)曲(qu)和傳(chuan)統大(da)曲(qu)質量差異的(de)(de)(de)生物(wu)(wu)和非生物(wu)(wu)因素及其作(zuo)用(yong)途(tu)徑。
2.分(fen)組設計(ji)：傳統發(fa)(fa)(fa)酵室和機械發(fa)(fa)(fa)酵室中分(fen)別采集(ji)發(fa)(fa)(fa)酵0 d、8 d、16 d、40 d的(de)樣(yang)品，即T00-T40和M00-M40，以及成熟樣(yang)品，即TM和MM，共10組高(gao)溫大曲樣(yang)本。
3.測(ce)序平臺(tai)：Illumina NovaSeq PE250
4.測序區域(yu)：細(xi)菌16S V3-V4區（338F/806R）、真菌ITS1（ITS1F/ITS2R）
5.其他分析：發酵(jiao)參數及酶活檢(jian)測、揮發性代(dai)謝物(wu)檢(jian)測、有機酸(suan)和氨基酸(suan)檢(jian)測等。
PART 3、研究結果
1.機械成品大(da)曲和傳(chuan)統(tong)成品大(da)曲品質具有顯(xian)著(zhu)差異(yi)
TM和(he)(he)MM理化性(xing)(xing)質和(he)(he)酶(mei)學特(te)性(xing)(xing)研究表(biao)明，TM具有較高(gao)(gao)的(de)還原(yuan)糖（RS）、總(zong)(zong)酸(suan)(suan)(suan)（TA）、總(zong)(zong)酯(zhi)（TE）含量(liang)和(he)(he)糖化活(huo)(huo)性(xing)(xing)，而MM具有較高(gao)(gao)的(de)水分和(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)性(xing)(xing)蛋白酶(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)。而液化活(huo)(huo)性(xing)(xing)和(he)(he)酯(zhi)化活(huo)(huo)性(xing)(xing)基本一致，均滿足釀酒(jiu)用(yong)大曲的(de)基本指標。代(dai)謝(xie)物(wu)檢測結果表(biao)明，氨(an)基酸(suan)(suan)(suan)和(he)(he)吡嗪(qin)(qin)類物(wu)質可能是傳統高(gao)(gao)溫大曲和(he)(he)機械高(gao)(gao)溫大曲的(de)主要(yao)差(cha)異(yi)代(dai)謝(xie)產物(wu)。其中(zhong)(zhong)(zhong)，TM和(he)(he)MM之間有30種差(cha)異(yi)揮發性(xing)(xing)有機物(wu)（P<0.05），TM中(zhong)(zhong)(zhong)吡嗪(qin)(qin)類、苯二氮雜類和(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)類含量(liang)均高(gao)(gao)于MM，而MM中(zhong)(zhong)(zhong)酮(tong)類和(he)(he)醇類含量(liang)較高(gao)(gao)。TM和(he)(he)MM中(zhong)(zhong)(zhong)蘋(pin)果酸(suan)(suan)(suan)（MA）、丁酸(suan)(suan)(suan)（BA）、琥珀酸(suan)(suan)(suan)（SA）、酒(jiu)石酸(suan)(suan)(suan)（TA）、乳酸(suan)(suan)(suan)（LA）、乙酸(suan)(suan)(suan)（AA）、檸檬酸(suan)(suan)(suan)（CA）等7種有機酸(suan)(suan)(suan)含量(liang)差(cha)異(yi)顯著（P<0.05），是TM和(he)(he)MM質量(liang)差(cha)異(yi)的(de)潛在(zai)影響因素（Fig.1）。
Fig.1：不同工藝成品高溫大曲發酵參數（A）、酶活指標（B）及差異(yi)代謝物（C-D）
2.高溫大曲(qu)發酵參數和(he)微(wei)生物群落的時(shi)間動態(tai)演(yan)替規律(lv)
大(da)曲(qu)發(fa)酵(jiao)(jiao)理化參數表(biao)明，HTD-M溫(wen)(wen)度變(bian)化趨(qu)勢出(chu)與(yu)HTD-T相似，但HTD-T的(de)溫(wen)(wen)度第7天達(da)到峰值（64.5 ℃），HTD-M在(zai)溫(wen)(wen)度第15天達(da)到峰值（62.0 ℃），現(xian)代機械(xie)壓榨使大(da)曲(qu)塊擴(kuo)散(san)，影(ying)響(xiang)發(fa)酵(jiao)(jiao)初期保溫(wen)(wen)。而發(fa)酵(jiao)(jiao)后(hou)期機械(xie)曲(qu)塊變(bian)得緊(jin)實，保溫(wen)(wen)性(xing)能提(ti)高(gao)，溫(wen)(wen)度上(shang)升速率快。水(shui)分含(han)量(liang)持續下降至接近(jin)11%，傳統(tong)大(da)曲(qu)在(zai)發(fa)酵(jiao)(jiao)前期水(shui)分散(san)失(shi)速率快，而機械(xie)大(da)曲(qu)水(shui)分則是(shi)在(zai)發(fa)酵(jiao)(jiao)后(hou)期散(san)失(shi)速率更(geng)快。RS、銨態氮(dan)（TAN）、總(zong)酸(suan)（TA）、總(zong)酯（TE）含(han)量(liang)均呈現(xian)先升高(gao)后(hou)降低的(de)趨(qu)勢，且T40均顯著高(gao)于M40。此(ci)外，T40的(de)糖化活(huo)性(xing)和酸(suan)性(xing)蛋白酶活(huo)性(xing)均高(gao)于M40，說明傳統(tong)發(fa)酵(jiao)(jiao)方(fang)式有利于HTD的(de)碳氮(dan)代謝(xie)（Fig.2）。
Fig.2：曲房溫度（A），發酵參數(shu)（B）及酶活指標(biao)（C）隨發酵時間的動(dong)態規律
基于(yu)序(xu)列100%相似性(xing)(xing)標準(zhun)共鑒定出(chu)16，166個細(xi)菌ASV和2，078個真菌ASV。T08中的Chao 1和Shannon指(zhi)數(shu)均顯著低(di)于(yu)M08中的Chao 1和Shannon指(zhi)數(shu)（P<0.05），并且(qie)在(zai)(zai)發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)后期(qi)情況(kuang)相反。同時，在(zai)(zai)發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)早期(qi)（溫(wen)度(du)較低(di)）HTD-M的真菌多樣性(xing)(xing)指(zhi)數(shu)，而(er)在(zai)(zai)發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)后期(qi)（溫(wen)度(du)較高）HTD-M中該(gai)指(zhi)數(shu)較低(di)。以(yi)上結果表(biao)明，高溫(wen)對ASVs的獨特性(xing)(xing)和微生物多樣性(xing)(xing)有抑制作用，且(qie)溫(wen)度(du)越高，趨同性(xing)(xing)越強(qiang)（Fig.3）。
Fig.3：HTD發酵過程中細菌（A-B）和真(zhen)菌（C-D）共有和特有的(de)ASVs；細菌群(qun)落(luo)（E）和真(zhen)菌群(qun)落(luo)（F）的(de)α多樣性指(zhi)數變化特征
微生物群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)相對定(ding)量分析表明(ming)(ming)，HTD發(fa)酵(jiao)過程中(zhong)細菌(jun)群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)變(bian)化顯著，優勢屬(shu)主(zhu)要為Staphylococcus、Lactococcus、Weissella、Kroppenstedtia、Bacillus和(he)Virgibacillus。而真(zhen)菌(jun)群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)差(cha)異較小，主(zhu)要是Thermomyces和(he)Thermoascus。基(ji)于(yu)(yu)Bray-Curtis距(ju)離矩陣的(de)PCA分析發(fa)現，由于(yu)(yu)初(chu)始發(fa)酵(jiao)期間HTD-T和(he)HTD-M之間的(de)溫度差(cha)異，T08和(he)M08樣品(pin)中(zhong)細菌(jun)群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)具有差(cha)異。而真(zhen)菌(jun)群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)沒有顯著差(cha)異，進一(yi)步說明(ming)(ming)細菌(jun)比真(zhen)菌(jun)更容易受到(dao)外(wai)界(jie)環境(jing)因素的(de)干擾。為深(shen)入了解群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)差(cha)異化的(de)原因，基(ji)于(yu)(yu)零模(mo)型(xing)分析β最近分類單元指數（βNTI），以生態位理(li)論評估(gu)HTD-T和(he)HTD-M群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)組(zu)(zu)裝(zhuang)模(mo)式的(de)差(cha)異，結果表明(ming)(ming)HTD-T發(fa)酵(jiao)細菌(jun)群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)是確(que)定(ding)性組(zu)(zu)裝(zhuang)，而HTD-M峰溫滯后影響了初(chu)期細菌(jun)群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)組(zu)(zu)裝(zhuang)模(mo)式，由隨機(ji)性組(zu)(zu)裝(zhuang)到(dao)確(que)定(ding)性組(zu)(zu)裝(zhuang)。兩種(zhong)模(mo)式下真(zhen)菌(jun)群(qun)(qun)(qun)(qun)落(luo)(luo)都是隨機(ji)性組(zu)(zu)裝(zhuang)（Fig.4）。
Fig.4：高溫大曲發酵(jiao)過程微生物(wu)群(qun)落結構和組裝(zhuang)模式
3. 確定傳(chuan)統與機械高溫大曲的靶標差異代(dai)謝產物
GC-MS在發(fa)(fa)酵大(da)曲(qu)中共檢(jian)測到(dao)(dao)87種(zhong)(zhong)揮發(fa)(fa)性化合物(wu)(wu)(wu)（VOCs），HPLC定量檢(jian)測了(le)大(da)曲(qu)發(fa)(fa)酵過程的(de)(de)10種(zhong)(zhong)有機(ji)酸(suan)(suan)和17種(zhong)(zhong)氨基(ji)酸(suan)(suan)。通過投影變量重要度（VIP）分析，篩選到(dao)(dao)16種(zhong)(zhong)差(cha)異VOCs（VIP>1.2）、3種(zhong)(zhong)差(cha)異有機(ji)酸(suan)(suan)和7種(zhong)(zhong)差(cha)異氨基(ji)酸(suan)(suan)（VIP>1.0）。進一步的(de)(de)Venn分析發(fa)(fa)現，發(fa)(fa)酵大(da)曲(qu)差(cha)異代(dai)謝物(wu)(wu)(wu)與成(cheng)品大(da)曲(qu)差(cha)異代(dai)謝物(wu)(wu)(wu)存在14種(zhong)(zhong)共同的(de)(de)差(cha)異代(dai)謝產(chan)物(wu)(wu)(wu)，作為后續研究的(de)(de)靶標差(cha)異代(dai)謝產(chan)物(wu)(wu)(wu)（Fig.5）。
Fig.5：揮發性化合物（A），有機酸（B）和(he)氨基酸（C）的(de)含量動(dong)態變化熱圖與(yu)氣泡(pao)圖以及基于VIP篩選的(de)差(cha)異代謝標志物瀑布圖（D）
4. 鎖定靶標(biao)差異化(hua)合物代謝潛在的ASV水平微生物
靶(ba)標差(cha)異(yi)代(dai)謝(xie)產物(wu)與優勢ASVs的Pearson相關(guan)分析結果表明，Bacillus、Virgibacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Monascus被認為是(shi)造成傳統(tong)高溫(wen)大(da)曲和機械高溫(wen)大(da)曲代(dai)謝(xie)表型差(cha)異(yi)的核心物(wu)種(zhong)，相應地，BA、精氨(an)酸（Arg）、四甲基吡嗪（TTMP）、三甲基吡嗪（TMP）和2-甲氧基-4-乙烯基苯(ben)酚（4-VG）被篩選為可(ke)調控的靶(ba)標差(cha)異(yi)代(dai)謝(xie)產物(wu)（Fig.6）。
Fig.6：核(he)心(xin)ASVs與(yu)目標代謝(xie)物之(zhi)間基于(yu)顯著相關性的網絡圖
5.從基因層面驗證引(yin)起目標代謝(xie)物差異(yi)的潛在微(wei)生物
為(wei)了進(jin)一步(bu)揭示大曲風(feng)味(wei)物(wu)(wu)質的(de)形成過(guo)程，基(ji)于KEGG（16S rRNA）和MetaCyc（ITS rRNA）數據庫，對大曲微生物(wu)(wu)的(de)功能譜進(jin)行預測。同時(shi)，利用PICRUSt 2預測了細菌和真菌群落中相關酶功能基(ji)因(yin)的(de)豐度變化。此(ci)外(wai)，我們關注(zhu)來自18個ASV的(de)酶分布，因(yin)為(wei)它(ta)們可(ke)能參(can)與(yu)與(yu)風(feng)味(wei)化合(he)物(wu)(wu)相關的(de)主要(yao)代謝途徑，包括Arg代謝、BA代謝、4-VG代謝和十六烷生物(wu)(wu)合(he)成（Fig.7）。
Fig.7：PICRUSt2預測的精氨酸、丁酸、四(si)甲(jia)基吡嗪和2-乙烯基愈(yu)創木酚代謝通路示意(yi)圖。熱圖表示核心ASVs中與上述代謝途徑相關酶的基因相對豐度
6. 探(tan)索高溫大(da)曲中驅動核心(xin)ASVs代謝的(de)生物(wu)和非生物(wu)因素(su)
18個(ge)(ge)(ge)核心ASVs的(de)(de)共線性(xing)網絡分為兩個(ge)(ge)(ge)模(mo)(mo)塊(kuai)，模(mo)(mo)塊(kuai)Ⅰ中，9個(ge)(ge)(ge)與(yu)Arg正(zheng)(zheng)相(xiang)關的(de)(de)ASVs之(zhi)間(jian)存在協(xie)同效應，而(er)與(yu)BA、TTMP、TMP、4-VG呈正(zheng)(zheng)相(xiang)關的(de)(de)9個(ge)(ge)(ge)ASVs構成模(mo)(mo)塊(kuai)Ⅱ中的(de)(de)正(zheng)(zheng)相(xiang)關網絡模(mo)(mo)式。一(yi)方面，兩個(ge)(ge)(ge)模(mo)(mo)塊(kuai)的(de)(de)ASVs均受到溫度(du)、TA和RS的(de)(de)正(zheng)(zheng)向驅(qu)動；另一(yi)方面，水分和淀粉與(yu)大多(duo)數ASVs呈負相(xiang)關。上(shang)述結(jie)果綜合表明(ming)，造(zao)成代(dai)謝差異(yi)的(de)(de)ASVs具(ju)有(you)(you)良好(hao)(hao)的(de)(de)耐(nai)高溫和耐(nai)酸特性(xing)，同時具(ju)有(you)(you)優異(yi)的(de)(de)原料分解和利用(yong)能(neng)力(li)，且低水分環境下能(neng)更好(hao)(hao)的(de)(de)發(fa)揮(hui)作用(yong)（Fig.8）。
Fig.8：核心(xin)(xin)ASVs的共線性(xing)網絡(luo)（A）以及發酵因子對核心(xin)(xin)ASVs的冗(rong)余分析（B-C）
PART 4、研究結(jie)論(lun)
1.在這項研究中，證明機械(xie)壓(ya)榨擴散大(da)曲是(shi)(shi)溫(wen)(wen)度管理模(mo)(mo)式差異的初始(shi)原因(yin)，它改變了微生(sheng)物的組裝(zhuang)模(mo)(mo)式和代(dai)謝(xie)(xie)(xie)表型(xing)。Arg、BA、TTMP、TMP、4-VG可(ke)(ke)能是(shi)(shi)影響大(da)曲質量的目標關鍵代(dai)謝(xie)(xie)(xie)物。Bacillus、Virgibacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Monascus是(shi)(shi)影響代(dai)謝(xie)(xie)(xie)變異的主要微生(sheng)物。高溫(wen)(wen)、高酸和低水分(fen)可(ke)(ke)能是(shi)(shi)導致熱脫附(fu)過程(cheng)中特征風(feng)味代(dai)謝(xie)(xie)(xie)的主要因(yin)素。
2.以上發現有助(zhu)于更好地理解機(ji)械熱處理中外部發酵環境改變微生態(tai)分化的機(ji)制(zhi)，為更好地管理和(he)提(ti)高熱處理質(zhi)量(liang)的新策略(lve)奠(dian)定(ding)理論基礎(chu)。同(tong)時，進一步(bu)通(tong)過(guo)宏轉錄組學和(he)宏蛋白質(zhi)組學解鎖HTD微生物區系功能的更多機(ji)制(zhi)，為HTD質(zhi)量(liang)改進可提(ti)供更多信息和(he)思路。
原文引(yin)用：Gailing Shi, Chao Fang, Shuang Xing, Ying Guo, Xin Li, Xiao Han, Liangcai Lin, Cuiying Zhang, Heterogenetic mechanism in high-temperature Daqu fermentation by traditional craft and mechanical craft: From microbial assembly patterns to metabolism phenotypes, Food Research International, Volume 187, 2024, 114327, ISSN 0963-9969.
原文鏈(lian)接(jie)：DOI: 10.1016/j.foodres.2024.114327
