2024-06-07
近(jin)日，上海(hai)(hai)交(jiao)通大學在醫(yi)學領域(yu)的(de)(de)《Marine drugs》發(fa)表新(xin)研究成果！本研究從(cong)南極深海(hai)(hai)中分離得到(dao)的(de)(de)海(hai)(hai)綿相(xiang)關細菌Streptomyces sp. DSS69基因(yin)(yin)組結果中挖掘了(le)一(yi)(yi)個(ge)可能負責大環(huan)內酰胺生(sheng)物(wu)(wu)合成的(de)(de)隱性基因(yin)(yin)簇(cu)，整(zheng)個(ge)生(sheng)物(wu)(wu)合成基因(yin)(yin)簇(cu)的(de)(de)克隆與異(yi)源表達促(cu)成了(le)weddelamycin的(de)(de)發(fa)現，并(bing)且(qie)闡明了(le)涉及(ji)weddelamycin產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)負向調節因(yin)(yin)子(zi)WdlO及(ji)兩個(ge)正(zheng)向調節因(yin)(yin)子(zi)WdlA和WdlB。本研究不僅為(wei)(wei)(wei)開發(fa)新(xin)的(de)(de)抗感染藥物(wu)(wu)提(ti)(ti)供了(le)一(yi)(yi)種新(xin)的(de)(de)聚烯(xi)內酰胺同系(xi)物(wu)(wu)，而且(qie)還為(wei)(wei)(wei)未來的(de)(de)組合生(sheng)物(wu)(wu)合成奠定(ding)了(le)基礎，以提(ti)(ti)高PMLs和其他相(xiang)關天然產(chan)(chan)物(wu)(wu)為(wei)(wei)(wei)基礎的(de)(de)藥物(wu)(wu)先導物(wu)(wu)的(de)(de)可用性。 本研究(jiu)的細菌基因組完(wan)(wan)成圖(tu)測序和分析由上海派森諾生(sheng)物科(ke)技股份有限公司完(wan)(wan)成。
1、研究背景 多(duo)烯大環(huan)(huan)內(nei)(nei)酰胺(an)（PMLs）是(shi)一類由16-34個(ge)環(huan)(huan)狀內(nei)(nei)酰胺(an)環(huan)(huan)構(gou)成(cheng)的(de)(de)(de)天(tian)(tian)然產物(wu)(wu)，該環(huan)(huan)上帶有兩個(ge)獨(du)立或分離的(de)(de)(de)多(duo)烯片段，這些片段常經歷分子(zi)內(nei)(nei)環(huan)(huan)化反(fan)應形成(cheng)復雜的(de)(de)(de)多(duo)環(huan)(huan)結構(gou)。由于(yu)結構(gou)多(duo)樣性(xing)，PMLs展(zhan)現出(chu)廣泛(fan)(fan)的(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)活(huo)性(xing)，包括抗(kang)病毒(du)、抗(kang)菌(jun)、抗(kang)真(zhen)菌(jun)及抗(kang)腫(zhong)瘤作(zuo)(zuo)用(yong)。陸地和海洋環(huan)(huan)境中(zhong)的(de)(de)(de)放線(xian)菌(jun)，特別(bie)是(shi)鏈(lian)霉(mei)菌(jun)，是(shi)自然PMLs的(de)(de)(de)主要生(sheng)產者(zhe)。另外，生(sheng)物(wu)(wu)信(xin)息學分析揭示了大量潛在PMLs的(de)(de)(de)隱性(xing)生(sheng)物(wu)(wu)合成(cheng)基因簇(cu)(cu)分布廣泛(fan)(fan)。實際上，基因組(zu)(zu)挖(wa)(wa)掘技術已(yi)成(cheng)功用(yong)于(yu)新PMLs的(de)(de)(de)鑒定。鑒于(yu)許多(duo)細菌(jun)菌(jun)株遺傳(chuan)操作(zuo)(zuo)的(de)(de)(de)難度，挑選特定基因簇(cu)(cu)進行異源(yuan)表達已(yi)成(cheng)為激活(huo)沉(chen)默基因簇(cu)(cu)、挖(wa)(wa)掘新天(tian)(tian)然產物(wu)(wu)基因組(zu)(zu)及表征生(sheng)物(wu)(wu)合成(cheng)途徑的(de)(de)(de)有效策略。
2、研究(jiu)材料與(yu)方法 1、實驗(yan)材料：南極深海中(zhong)分離得(de)到的海綿相關(guan)細菌Streptomyces sp. DSS69 2、測序平臺：PacBio+Illumina 3、分析(xi)內(nei)容：細菌基(ji)因(yin)組(zu)完成圖測序、16S序列(lie)比(bi)對、次級代謝產物基(ji)因(yin)簇分析。
3、研究結果 基因組(zu)測序和產次級代謝產物能力鑒定 Streptomyces sp. DSS69全(quan)基因組(zu)測序結(jie)果(guo)顯(xian)示(shi)，其(qi)基因組(zu)大小為(wei)7.7Mb，GC含(han)量(liang)為(wei)71.7%，染色(se)體(ti)為(wei)線(xian)性(xing)結(jie)構。16S rDNA比對表明，DSS69菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)與S.microflavus NA06532和(he)S.fulvorobeus DSM 41455親緣關系最(zui)近。antiSMASH分析發(fa)(fa)現(xian)DSS69菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)基因組(zu)中(zhong)(zhong)(zhong)含(han)有36個假定的(de)(de)(de)次生(sheng)代謝產物(wu)(wu)BGCs，共(gong)有1.36 Mb，占全(quan)基因組(zu)的(de)(de)(de)17.7%。這(zhe)些(xie)BGCs負(fu)責四種(zhong)(zhong)(zhong)聚酮、八(ba)種(zhong)(zhong)(zhong)非(fei)核(he)糖(tang)體(ti)肽(tai)(tai)、三種(zhong)(zhong)(zhong)雜(za)交PK-NRPs、六種(zhong)(zhong)(zhong)核(he)糖(tang)體(ti)合(he)成(cheng)和(he)翻譯后修飾肽(tai)(tai)和(he)其(qi)他十五(wu)種(zhong)(zhong)(zhong)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)合(he)成(cheng)。BGC15是(shi)DSS69菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)是(shi)一種(zhong)(zhong)(zhong)假定的(de)(de)(de)I型聚酮合(he)成(cheng)酶(PKS) BGC。它在基因組(zu)成(cheng)和(he)基因排(pai)列上顯(xian)示(shi)了(le)與幾種(zhong)(zhong)(zhong)多(duo)烯大環內酯類抗生(sheng)素(su)生(sheng)物(wu)(wu)合(he)成(cheng)基因簇的(de)(de)(de)高度相似性(xing)，這(zhe)意(yi)味著它們可能共(gong)享類似的(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)合(he)成(cheng)途徑和(he)機制。然而(er)，進行(xing)了(le)大量(liang)的(de)(de)(de)嘗(chang)試(shi)，但未(wei)(wei)能從DSS69菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)發(fa)(fa)酵培養物(wu)(wu)中(zhong)(zhong)(zhong)鑒定出bombyxamycin或(huo)piceamycin，wdl BGC可能在DSS69菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)處于靜默狀態，或(huo)者編碼的(de)(de)(de)是(shi)一種(zhong)(zhong)(zhong)未(wei)(wei)知(zhi)的(de)(de)(de)化(hua)合(he)物(wu)(wu)。這(zhe)一結(jie)果(guo)進一步強調(diao)了(le)通(tong)過異源表達該(gai)基因簇來發(fa)(fa)現(xian)新化(hua)合(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)重要性(xing)，并提示(shi)DSS69菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)可能存在獨(du)特的(de)(de)(de)代謝潛力等待揭示(shi)。 圖1 DSS69菌株基(ji)因(yin)組圈圖和wdl BGC基(ji)因(yin)簇的比較圖 weddellamycin的分(fen)離(li)與鑒定 本研究構建(jian)了(le)(le)一(yi)個(ge)(ge)包(bao)含(han)(han)目標基(ji)因簇的(de)(de)BAC文(wen)庫，旨在將原本在DSS69菌株中(zhong)可能未表(biao)(biao)達或低(di)表(biao)(biao)達的(de)(de)wdl BGC轉移到(dao)一(yi)個(ge)(ge)更適宜的(de)(de)宿(su)主中(zhong)進行高效表(biao)(biao)達。通過PCR實驗，篩選(xuan)并(bing)(bing)獲(huo)得了(le)(le)一(yi)個(ge)(ge)包(bao)含(han)(han)完整wdl BGC的(de)(de)BAC克隆，命名為pBAC-wdl，將此克隆轉入(ru)到(dao)S.lividans GX28這一(yi)已知能夠有效表(biao)(biao)達外源(yuan)(yuan)基(ji)因簇的(de)(de)模型宿(su)主中(zhong)。高效液相色譜發現(xian)在經過異源(yuan)(yuan)表(biao)(biao)達的(de)(de)S.lividans GX28/pBAC-wdl菌株的(de)(de)培養物(wu)(wu)中(zhong)出現(xian)了(le)(le)一(yi)個(ge)(ge)新的(de)(de)化合物(wu)(wu)峰，表(biao)(biao)明異源(yuan)(yuan)表(biao)(biao)達成功激活了(le)(le)目標基(ji)因簇并(bing)(bing)產(chan)生了(le)(le)新的(de)(de)代(dai)謝產(chan)物(wu)(wu)。隨后，從10L規模的(de)(de)發酵培養物(wu)(wu)中(zhong)分(fen)離純(chun)化了(le)(le)這個(ge)(ge)新化合物(wu)(wu)，即weddellamycin(1)，并(bing)(bing)對其(qi)進行了(le)(le)詳細的(de)(de)化學結構和生物(wu)(wu)活性特(te)征分(fen)析。 圖2 S. lividans GX28/pBAC-wdl中weddellamycin(1)的(de)鑒(jian)定 化合(he)物1為(wei)(wei)黃色粉末(mo)，經(jing)過一系列鑒(jian)定(ding)后將其命(ming)名為(wei)(wei)weddellamycin。weddellamycin(1)的結(jie)構與piceamycin相似(si)，除(chu)了(le)一個新出現的六元(yuan)二(er)氫吡喃-4- 1環(huan)(huan)與piceamycin的2-環(huan)(huan)戊酮環(huan)(huan)融合(he)，這導致其形成(cheng)了(le)一個不尋常的三(san)環(huan)(huan)骨架(jia)。因此，化合(he)物1是一個獨特的23/5/6-三(san)環(huan)(huan)聚烯(xi)內酰胺。 weddellamycin生物合成途徑 wdl BGC與piceamycin/bombyxamycin BGC之(zhi)間(jian)的基因-基因高度相似表明，weddellamycin的產生(sheng)途徑(jing)除了最后的環化(hua)步(bu)驟(zou)外，其生(sheng)物(wu)合(he)成(cheng)途徑(jing)類(lei)似于piceamycin和bombyxamycin。 圖3 提出的weddellamycin (1)生物(wu)合成途徑 提高weddellamycin的產量研究 由于化合(he)物(wu)1與其他PLMs一樣不是很穩定(ding)，并且其在異(yi)源表達宿(su)主中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)產量很低，很難(nan)積(ji)累足夠的(de)(de)純(chun)底物(wu)進(jin)行生物(wu)活性試驗(yan)，故轉向wdl BGC定(ding)位的(de)(de)調控(kong)(kong)基(ji)因(yin)(yin)來提(ti)高產量。wdl基(ji)因(yin)(yin)簇(cu)編碼1個(ge)(ge)(ge)LuxR家(jia)族調控(kong)(kong)子(zi)(zi)(zi)(WdlA)、2個(ge)(ge)(ge)TetR家(jia)族調控(kong)(kong)子(zi)(zi)(zi)(WdlB和(he)(he)WdlO)和(he)(he)1個(ge)(ge)(ge)GntR調控(kong)(kong)子(zi)(zi)(zi)(WdlU)。為了(le)研(yan)究這些調節因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)在weddellamycin產生中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)作用(yong)，使用(yong)λ RED介導的(de)(de)PCR靶向技(ji)術，從pBAC-wdl中(zhong)(zhong)(zhong)分別敲(qiao)除了(le)wdlA、wdlB、wdlO和(he)(he)wdlU。將得到的(de)(de)4個(ge)(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)缺(que)失質粒通(tong)過(guo)偶(ou)聯轉移(yi)到S. lividans GX28中(zhong)(zhong)(zhong)，得到4個(ge)(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)缺(que)失突(tu)變體。發酵提(ti)取(qu)物(wu)的(de)(de)HPLC分析(xi)顯示，WdlA和(he)(he)WdlB在weddellamycin生物(wu)合(he)成的(de)(de)調控(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)起著積(ji)極作用(yong)，WdlO起著消極作用(yong)，WdlU起著不可檢測的(de)(de)作用(yong)。 圖4 wdlA、wdlB、wdlO和wdlU基因缺失對weddellamycin生物合成的(de)影響(xiang) 為(wei)了確認wdlA和(he)(he)wdlB的(de)(de)調控作用，并進一步增(zeng)加weddellamycin的(de)(de)產(chan)量，在S. lividans GX28/pBAC-wdl和(he)(he)GX28/pBAC-?wdlO中，通(tong)過整合(he)構建(jian)子kasOp*控制(zhi)下，wdlA和(he)(he)/或(huo)wdlB過表達(da)。如預期一致(zhi)，與親本菌(jun)株(zhu)GX28/pBAC-wdl相比，所有過表達(da)突變體的(de)(de)weddellamycin發(fa)酵滴度都(dou)大幅提高(gao)。定(ding)量分析顯示，與S. lividans GX28/pBAC-wdl相比，wdlA和(he)(he)wdlB過表達(da)的(de)(de)GX28/?wdlO+OwdlAB中weddellamycin的(de)(de)產(chan)量提高(gao)最為(wei)顯著。 圖5過(guo)表達(da)wdlA和/或wdlB對S.lividans GX28/pBAC-wdl和GX28/pBAC-?wdlO中(zhong)weddellamycin生成的影響(xiang) 生物活性(xing) 測定了weddellamycin對(dui)7種(zhong)革(ge)蘭氏陽性(xing)(xing)(xing)菌(jun)(jun)(jun)、1種(zhong)真菌(jun)(jun)(jun)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)和1種(zhong)革(ge)蘭氏陰(yin)性(xing)(xing)(xing)菌(jun)(jun)(jun)的抑菌(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)，結果發現weddellamycin對(dui)所(suo)有(you)革(ge)蘭氏陽性(xing)(xing)(xing)細菌(jun)(jun)(jun)和真菌(jun)(jun)(jun)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)都有(you)較強的抑制活(huo)性(xing)(xing)(xing)，而weddellamycin對(dui)革(ge)蘭氏陰(yin)性(xing)(xing)(xing)桿菌(jun)(jun)(jun)大腸桿菌(jun)(jun)(jun)無有(you)效(xiao)活(huo)性(xing)(xing)(xing)。 表(biao)1 化(hua)合(he)物1的(de)抑菌活性 測定weddellamycin對人白血病HL-60、人肝癌HepG2、人膠(jiao)質母細胞(bao)瘤U-87MG、人結腸(chang)癌HCT 116的(de)體(ti)外細胞(bao)毒性。結果表明，化合物(wu)1對這些細胞(bao)系具有較強的(de)細胞(bao)毒性，IC50值在2.07 ~ 11.50μM之(zhi)間。 表2 化(hua)合物1的細(xi)胞毒性活性
4、結 論 本研(yan)究對南極深(shen)海(hai)海(hai)綿樣本中分離得到(dao)的(de)(de)Streptomyces sp. DSS69進行全基因(yin)組測序，通過基因(yin)組挖掘(jue)鑒定(ding)出一個(ge)隱(yin)型(xing)多烯內酰(xian)胺(an)生(sheng)物(wu)合成基因(yin)簇(cu)wdl。結合BAC文庫和異源表(biao)達的(de)(de)策略(lve)成功激活(huo)wdl BGC，從而鑒定(ding)出一種(zhong)新的(de)(de)PML，名為weddellamycin（1），它含有(you)獨特的(de)(de)23/5/6-三(san)環大內酰(xian)胺(an)支架。本研(yan)究提出了化合物(wu)1的(de)(de)生(sheng)物(wu)合成途徑，并發現三(san)個(ge)位于基因(yin)簇(cu)的(de)(de)調節(jie)基因(yin)（wdlA、wdlB和wdlO）能(neng)夠調節(jie)weddellamycin（1）的(de)(de)產(chan)量。此外，weddellamycin（1）被證實對真菌病原體(ti)以及革蘭氏(shi)陽性(xing)細(xi)菌，具有(you)活(huo)性(xing)。
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文章索引：Chen, Lu, et al. The Discovery of Weddellamycin, a Tricyclic Polyene Macrolactam Antibiotic from an Antarctic Deep-Sea-Derived Streptomyces sp. DSS69, by Heterologous Expression. Marine Drugs 22.4 (2024): 189.
