2024-06-17
近日，華中(zhong)農(nong)業(ye)大(da)學在《Horticulture Research》發(fa)(fa)表(biao)新(xin)研(yan)究成果(guo)！本研(yan)究將一(yi)(yi)個黃油(you)生(sheng)菜(cai)品(pin)種（同(tong)樣攜帶(dai)Lskipk突變）與(yu)一(yi)(yi)個結(jie)球(qiu)生(sheng)菜(cai)品(pin)種雜交(jiao)，并進(jin)行了(le)BSR遺傳(chuan)定位分析，鑒定出一(yi)(yi)個新(xin)的(de)編碼ATP酶的(de)基因，該基因同(tong)樣對(dui)黃油(you)生(sheng)菜(cai)的(de)株(zhu)型(xing)有(you)所貢獻。進(jin)一(yi)(yi)步(bu)通過敲除與(yu)互補實驗(yan)驗(yan)證了(le)LsATPase功(gong)能的(de)缺失也是(shi)形成黃油(you)生(sheng)菜(cai)株(zhu)型(xing)所必需的(de)。本研(yan)究結(jie)果(guo)不僅增進(jin)了(le)對(dui)控制生(sheng)菜(cai)等蔬菜(cai)作物特定性(xing)狀遺傳(chuan)基礎的(de)理解(jie)，也為實現(xian)作物品(pin)種的(de)精準設計(ji)和高效培育奠定了(le)理論與(yu)實踐(jian)基礎，有(you)望在未(wei)來的(de)農(nong)業(ye)可(ke)持續(xu)發(fa)(fa)展中(zhong)發(fa)(fa)揮重要(yao)作用。 本研(yan)究的BSR測序和(he)分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。 研究(jiu)背(bei)景 植物(wu)(wu)的株(zhu)(zhu)型(xing)特征(zheng)是(shi)一個綜(zong)合性(xing)的表型(xing)，受(shou)到多(duo)種基因(yin)(yin)和(he)環境因(yin)(yin)素的調控(kong)。對于(yu)觀賞植物(wu)(wu)和(he)葉類蔬菜(cai)而(er)言，植物(wu)(wu)株(zhu)(zhu)型(xing)也是(shi)一種感官性(xing)狀。因(yin)(yin)此，鑒定調控(kong)植物(wu)(wu)株(zhu)(zhu)型(xing)的關鍵基因(yin)(yin)并闡明其功能(neng)機制(zhi)，對未來(lai)的作物(wu)(wu)理(li)想株(zhu)(zhu)型(xing)育(yu)種具有重(zhong)要意義。 生(sheng)菜作(zuo)(zuo)為一種全球范圍內重要的(de)(de)葉類蔬菜作(zuo)(zuo)物(wu)(wu)(wu)(wu)，展現(xian)出了(le)豐富的(de)(de)植(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)株(zhu)型(xing)(xing)(xing)變異(yi)。然而，形成這種緊湊型(xing)(xing)(xing)植(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)株(zhu)型(xing)(xing)(xing)背后的(de)(de)遺(yi)傳與(yu)分子機制尚未完全明(ming)了(le)。本(ben)研究旨在探討黃油生(sheng)菜植(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)株(zhu)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)遺(yi)傳基(ji)礎，通(tong)過構(gou)建分離群體(ti)，遺(yi)傳克隆了(le)控(kong)制黃油生(sheng)菜植(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)株(zhu)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)兩(liang)個基(ji)因，這兩(liang)個新基(ji)因通(tong)過調控(kong)細胞(bao)壁的(de)(de)發育來影(ying)響黃油生(sheng)菜的(de)(de)植(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)株(zhu)型(xing)(xing)(xing)。 研究材(cai)料(liao)與方法 1.實驗材料(liao)：黃油生菜(cai)品種(zhong)（W6-29885）、莖用生菜(cai)品種(zhong)（W1168）以及(ji)其雜交構建(jian)的子代家系、莖用生菜(cai)（Y37）、散葉生菜(cai)（S1）以及(ji)其雜交構建(jian)的子代家系、結球(qiu)生菜(cai)等。 2.測序平臺：Illumina 3.分(fen)析(xi)內容：BSR測序(xu)分(fen)析(xi)、CRISPR/Cas9敲除(chu)、轉基因互補、RNA-seq、電鏡、RT-PCR等。 研(yan)究結果 控制緊湊(cou)型(xing)株型(xing)的(de)基因座與黃油生(sheng)菜株型(xing)的(de)位點重疊 本文通(tong)過(guo)莖用生菜(cai)品種(zhong)(zhong)與黃油生菜(cai)品種(zhong)(zhong)雜交構建了(le)(le)一個(ge)(ge)(ge)分(fen)離群(qun)體，并(bing)利用F3代家系(xi)克(ke)隆了(le)(le)一個(ge)(ge)(ge)控制(zhi)黃油生菜(cai)植(zhi)(zhi)物(wu)株型的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)。由于單一基(ji)(ji)因(yin)不(bu)(bu)足以解釋黃油生菜(cai)的(de)(de)植(zhi)(zhi)物(wu)株型，作者進一步(bu)構建了(le)(le)另(ling)一個(ge)(ge)(ge)分(fen)離群(qun)體，遺傳克(ke)隆了(le)(le)控制(zhi)黃油生菜(cai)植(zhi)(zhi)物(wu)株型的(de)(de)第二個(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)因(yin)。與結球生菜(cai)葉簇(cu)形成(cheng)的(de)(de)機制(zhi)不(bu)(bu)同，這(zhe)兩(liang)個(ge)(ge)(ge)新基(ji)(ji)因(yin)通(tong)過(guo)調控細胞壁(bi)的(de)(de)發育來影響黃油生菜(cai)的(de)(de)植(zhi)(zhi)物(wu)株型。 圖1 遺傳定位(wei)控制黃油(you)生菜(cai)緊(jin)密株型的基(ji)因(yin) LsKIPK功能的(de)喪(sang)失有助于(yu)緊(jin)湊(cou)的(de)植物株型和黃油(you)生菜株型的(de)形(xing)成 敲除LsKIPK得到(dao)2個突變(bian)體(ti)，均(jun)展現出緊湊型(xing)株(zhu)型(xing)（圖(tu)(tu)2A），互補陽性株(zhu)均(jun)變(bian)為散葉(xie)型(xing)（圖(tu)(tu)2C）。將(jiang)LsKIPK的(de)互補質粒轉(zhuan)入(ru)黃油生菜品(pin)種(zhong)PI370472中，其轉(zhuan)化(hua)株(zhu)的(de)株(zhu)型(xing)轉(zhuan)變(bian)為散葉(xie)型(xing)（圖(tu)(tu)2D）。因此(ci)，LsKIPK功(gong)能的(de)缺(que)失也促(cu)成了(le)黃油生菜的(de)株(zhu)型(xing)和緊湊型(xing)株(zhu)型(xing)。 proLsKIPK:：GUS轉(zhuan)基因株系的GUS染(ran)(ran)色(se)顯(xian)示，LsKIPK在中脈和(he)葉片(pian)中高表(biao)達，在頂端分生組織、莖、根和(he)成(cheng)熟花瓣(ban)中中等表(biao)達（圖(tu)2E）。RT-qPCR結(jie)果與GUS染(ran)(ran)色(se)結(jie)果一致。亞細(xi)胞定(ding)位顯(xian)示LsKIPK蛋白位于細(xi)胞膜上（圖(tu)2G）。 圖2 LsKIPK的功能驗證(zheng) 所有黃油生(sheng)菜品種(zhong)都有Lskipk和Lsatpase的(de)突(tu)變 從660份(fen)生(sheng)菜資(zi)源中(zhong)篩選出34個(ge)結球(qiu)生(sheng)菜品種，其(qi)中(zhong)11個(ge)的LsKIPK基因(yin)存在一個(ge)點(dian)突（A633V），命(ming)名為(wei)Lskipk1（圖3A）。PI577117（Lskipk1）互補陽性(xing)(xing)轉基因(yin)株(zhu)（COM#35-2）的株(zhu)形(xing)變(bian)為(wei)散葉，表(biao)明Lskipk1同樣是非功能性(xing)(xing)的，并且對結球(qiu)生(sheng)菜的株(zhu)形(xing)有貢獻（圖3B）。 調(diao)查生(sheng)菜資源中LsATPase的(de)基(ji)因(yin)型，發(fa)現所有34個(ge)(ge)(ge)結(jie)球生(sheng)菜均(jun)攜帶(dai)有Lsatpase等(deng)位基(ji)因(yin)，與本文(wen)結(jie)論一致，即LsATPase功能(neng)喪失是結(jie)球生(sheng)菜植株(zhu)形態所需(xu)的(de)；在38個(ge)(ge)(ge)莖(jing)用生(sheng)菜中，有30個(ge)(ge)(ge)擁有Lsatpase1等(deng)位基(ji)因(yin)。除結(jie)球生(sheng)菜和莖(jing)用生(sheng)菜外，其他(ta)園藝類型的(de)LsATPase均(jun)為(wei)野生(sheng)型。相(xiang)比之下(xia)，其他(ta)園藝類型中沒有一個(ge)(ge)(ge)是雙突變體，盡管(guan)62.5%到88.9%為(wei)單突變體（圖4C）。表(biao)明LsKIPK和LsATPase的(de)功能(neng)缺(que)失對于(yu)結(jie)球生(sheng)菜的(de)植株(zhu)形態是必要的(de)。 圖(tu)3 Lsatpase基因LsKIPK和LsATPase功能的喪(sang)失(shi)有助于黃油(you)生(sheng)成株(zhu)型的形(xing)成 Lskipk-Lsatpase雙突(tu)變體具(ju)有較小(xiao)的葉片和葉角(jiao) 敲(qiao)(qiao)除株(zhu)的葉(xie)片長(chang)、寬、大(da)小(xiao)及角度(du)均小(xiao)于受體植物（圖4A-C），說明雙突（Lskipk Lsatpase）而非(fei)單突變體具有減(jian)小(xiao)的葉(xie)片尺(chi)寸(cun)。與野生型受體相比，敲(qiao)(qiao)除株(zhu)的細胞長(chang)度(du)顯著縮(suo)短（圖4D）。因此，Lskipk Lsatpase通過減(jian)少(shao)細胞長(chang)度(du)來減(jian)小(xiao)葉(xie)片尺(chi)寸(cun)。 葉(xie)片中脈的橫截面顯示(shi)，敲除株(zhu)的中脈比受(shou)體的更(geng)寬(kuan)且厚（圖4E）。此外(wai)，敲除株(zhu)中脈所需的最小(xiao)折斷(duan)力顯著高于野生(sheng)型(xing)受(shou)體（圖4F），并且敲除株(zhu)的葉(xie)片聯合(he)長度明顯長于受(shou)體（圖4G和H）。因此，Lskipk Lsatpase通過增強(qiang)葉(xie)片中脈和葉(xie)片聯合(he)的機械強(qiang)度來減(jian)小(xiao)葉(xie)片角度。 圖4 Lskipk-Lsatpase雙突的形態學研究(jiu) LsKIPK和LsATPase在(zai)細胞(bao)壁(bi)和纖維(wei)素發育(yu)中的作用 已知(zhi)背腹性基因(yin)主要(yao)富集在(zai)“細(xi)(xi)胞壁組織或生物合成(cheng)”、“外部包裹(guo)結構(gou)組織”和(he)(he)(he)“多糖代謝過(guo)(guo)程”（圖5A和(he)(he)(he)B）；RT-qPCR結果顯示，這(zhe)些基因(yin)在(zai)LsKIPK-COM和(he)(he)(he)LsATPase-COM植株中顯著高表達（圖5C）。綜合這(zhe)些結果表明(ming)，LsKIPK和(he)(he)(he)LsATPase可能通過(guo)(guo)影(ying)響參與(yu)細(xi)(xi)胞壁發(fa)育基因(yin)的表達來改(gai)變細(xi)(xi)胞形(xing)態。 TEM結果顯(xian)示：LsKIPK和LsATPase可能通過影響細(xi)胞(bao)(bao)形態和細(xi)胞(bao)(bao)壁發(fa)育，從而貢獻(xian)于結球生菜特有的植株結構(gou)。 圖5 LsKIPK和LsATPase影響細胞(bao)壁的發(fa)育 結 論 1、Lskipk和(he)Lsatpase的(de)雙(shuang)重(zhong)突變對于結(jie)球(qiu)生菜緊湊(cou)植株(zhu)結(jie)構的(de)形成既是必要的(de)也是充分(fen)的(de)。 2、LsATPase與(yu)LsKIPK之間的關(guan)系對于(yu)全面揭(jie)示決定生菜特有形態特征的遺(yi)傳基(ji)礎至關(guan)重要(yao)。 3、Lskipk-Lsatpase通過(guo)調節細(xi)胞壁發育控制生菜的株(zhu)型。 4、緊湊(cou)株型的生菜是生產的理想類(lei)型。 總(zong)結而言，本研究不僅增進了對控制生菜(cai)等蔬菜(cai)作(zuo)物(wu)特定性(xing)狀遺傳基(ji)礎的理(li)解，也(ye)為(wei)實現作(zuo)物(wu)品種(zhong)的精準設計和高效(xiao)培(pei)育奠定了理(li)論與實踐基(ji)礎，有望在(zai)未來的農業可持續(xu)發(fa)展中發(fa)揮重(zhong)要作(zuo)用(yong)。 如需(xu)進一步討論，歡迎發郵(you)(you)件或者(zhe)致電我們喲（郵(you)(you)箱地址：genome_support@doudin.cn，聯系電話：021-80118168-6611）！ 文章索引：Xie, Sai, et al. Lskipk Lsatpase double mutants are necessary and sufficient for the compact plant architecture of butterhead lettuce.Horticulture Research, 2024, 11: uhad280.
