全球女性因(yin)為乳(ru)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)而死亡(wang)的(de)(de)(de)人(ren)(ren)數(shu)逐(zhu)年(nian)上升，并且趨向年(nian)輕化，乳(ru)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)逐(zhu)步(bu)成為女性癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥死亡(wang)的(de)(de)(de)“冷酷(ku)殺手”，其發(fa)展趨勢(shi)越來越令人(ren)(ren)擔(dan)憂(you)。近年(nian)來，大(da)量的(de)(de)(de)研究表明腸(chang)(chang)道(dao)(dao)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)在(zai)(zai)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥發(fa)生(sheng)和(he)(he)發(fa)展中(zhong)(zhong)(zhong)發(fa)揮著非(fei)常重要的(de)(de)(de)作用，腸(chang)(chang)道(dao)(dao)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)組對宿主存在(zai)(zai)多種影(ying)響，例如在(zai)(zai)乳(ru)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)中(zhong)(zhong)(zhong)，存在(zai)(zai)于乳(ru)腺(xian)(xian)組織和(he)(he)腸(chang)(chang)道(dao)(dao)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)具有相似的(de)(de)(de)組成和(he)(he)功能(neng)(neng)。盡管已經報道(dao)(dao)了乳(ru)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)患(huan)者腸(chang)(chang)道(dao)(dao)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)的(de)(de)(de)組成和(he)(he)功能(neng)(neng)特征，但(dan)腸(chang)(chang)道(dao)(dao)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)與乳(ru)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)之間的(de)(de)(de)詳細因(yin)果關系仍不明確。本研究對臨床中(zhong)(zhong)(zhong)乳(ru)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)和(he)(he)良性乳(ru)腺(xian)(xian)疾(ji)病患(huan)者的(de)(de)(de)腸(chang)(chang)道(dao)(dao)菌(jun)群譜系的(de)(de)(de)組成進(jin)(jin)行(xing)了差異分析，并建立小(xiao)鼠乳(ru)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)模型，利用非(fei)標(biao)定量蛋白譜、DNA甲基(ji)化、靶向代(dai)謝分析等技術，多角度探索P. copri 在(zai)(zai)促(cu)進(jin)(jin)乳(ru)腺(xian)(xian)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)發(fa)展過程中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)因(yin)果關系和(he)(he)機制。

1.實驗(yan)目(mu)的：以(yi)臨床中乳腺癌和(he)良性乳腺疾病患者的腸道微生(sheng)物作(zuo)為研究(jiu)(jiu)對(dui)象，通過高通量測序手段檢測腸道微生(sheng)物組成，并建立(li)小鼠乳腺癌模(mo)型，利用非標定量蛋白譜、DNA甲基化譜、靶向代(dai)謝(xie)分析等技術，探(tan)究(jiu)(jiu)Prevotella copri 對(dui)乳腺癌影響(xiang)及其(qi)因果關系和(he)機制。

2.分組設計：

a)臨床研究設計：共2個分組，共取(qu)樣42例(li)乳腺癌(CA)患者和40例(li)良性乳腺疾病(NC)患者的糞便樣本。

b)小鼠(shu)乳腺癌模型：共4個分(fen)組(zu)(zu)，分(fen)別為SPF-Ctrl/SPF-P組(zu)(zu)，GF-Ctrl/GF-P組(zu)(zu)，P組(zu)(zu)為口服Prevotella copri ；在第8天時，將4T1細胞(bao)或(huo)EMT6細胞(bao)接種于小鼠(shu)右側第四乳脂(zhi)墊皮下。

c)IPyA實(shi)驗(yan)：當腫瘤體(ti)積達到約30mm3時(shi)，再分為SPF-Ctrl組(zu)和SPF-IPyA組(zu)。SPF-IPyA組(zu)為對小鼠進行灌胃IPyA溶(rong)液 3周(zhou)。

3.測序平臺：Illumina MiSeq PE250

4.測序區(qu)域：細菌16s V3-V4區(qu)（338F/806R）

5.其他分析(xi)：熒光(guang)原位雜交(jiao)（FISH）/四維非標定(ding)量(liang)蛋白質譜/DNA甲(jia)基化譜/靶向(xiang)代謝(xie)組學等技術(shu)。

1.P. copri增加與(yu)乳腺癌的發生發展密切相關(guan)

通過研究(jiu)發現，乳(ru)腺癌（CA）患者組(zu)(zu)(zu)的(de)腸(chang)道微生(sheng)物α多樣性顯著(zhu)低(di)(di)于良(liang)性乳(ru)腺疾(ji)病(NC)患者組(zu)(zu)(zu)。主坐標分(fen)析(PCoA)表(biao)(biao)明CA組(zu)(zu)(zu)的(de)β多樣性與NC組(zu)(zu)(zu)差異顯著(zhu)。LEfSe分(fen)析發現CA組(zu)(zu)(zu)的(de)Bifidobacterium, Collinsella, Faecalibacterium, Ruminococcus, 和(he)Selenomonas的(de)相對豐(feng)度顯著(zhu)降低(di)(di)，而Succinispira 和(he)Prevotella 的(de)相對豐(feng)度顯著(zhu)升高。此外，在所有(you)參與者中，P. copri 是Prevotella 的(de)優(you)勢種，而且P. copri 在CA組(zu)(zu)(zu)的(de)腸(chang)道微生(sheng)物中更(geng)加(jia)豐(feng)富。這(zhe)些(xie)發現表(biao)(biao)明，Prevotella的(de)增加(jia)，特別(bie)是P. copri，與乳(ru)腺癌的(de)發生(sheng)密切相關。

Fig.1：乳腺癌患者的腸道微(wei)生物群特(te)征

2.P. copri促進4T1小鼠模型(xing)中乳腺(xian)癌生長

采用4T1小(xiao)(xiao)鼠乳(ru)腺癌模型，探(tan)討P. copri 在乳(ru)腺癌發生發展中(zhong)的(de)(de)作(zuo)用。在接種(zhong)4T1細胞前，對SPF-P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)和GF-P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)口服P. copri ，結果(guo)發現，口服P. copri 的(de)(de)GF小(xiao)(xiao)鼠(GF-P)的(de)(de)4T1腫瘤(liu)生長速度(du)明(ming)顯(xian)(xian)高(gao)于GF-Ctrl。SPF-P和GF-P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)(de)腫瘤(liu)顯(xian)(xian)著(zhu)重于其對應組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)。此外(wai)，SPF-P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)糞便(bian)中(zhong)P. copri 的(de)(de)相對豐(feng)度(du)顯(xian)(xian)著(zhu)高(gao)于SPF-Ctrl組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)。在GF小(xiao)(xiao)鼠中(zhong)，GF-P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)糞便(bian)微生物以(yi)P. copri 為(wei)主(zhu)。熒光原位雜(za)交證實了P. copri 在GF-P組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)腸(chang)道中(zhong)的(de)(de)定植。這些結果(guo)表明(ming)P. copri的(de)(de)富集在乳(ru)腺癌的(de)(de)發展中(zhong)起著(zhu)關鍵(jian)作(zuo)用。

Fig.2: P. copri 可(ke)促進SPF和GF小鼠4T1腫瘤的(de)生長

Fig.3：P. copri 在SPF和GF小鼠的腸道中定植

3.在P. copri 影響乳腺(xian)癌的過程中，AMP活(huo)化(hua)蛋白激酶(AMPK)信號通(tong)路被PHD和(he)UHRF1調控的DNA甲基化(hua)抑制

本(ben)研究共發現51個(ge)差異表(biao)達蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質，其(qi)中(zhong)38個(ge)顯著(zhu)上(shang)調(diao)，13個(ge)顯著(zhu)下調(diao)。其(qi)中(zhong)轉錄蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)UHRF1的(de)(de)上(shang)調(diao)在(zai)(zai)表(biao)觀遺傳控制(zhi)中(zhong)起著(zhu)關鍵作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)。經WB驗證，UHRF1在(zai)(zai)腫瘤(liu)中(zhong)的(de)(de)表(biao)達在(zai)(zai)GF-P組顯著(zhu)高于GF-Ctrl組；在(zai)(zai)SPF-P組有上(shang)調(diao)的(de)(de)趨勢。此外，DNA甲(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)轉移酶3A在(zai)(zai)SPF-P和(he)(he)GF-P組中(zhong)增(zeng)加(jia)。RRBS結果顯示，GF-P組的(de)(de)整體(ti)甲(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)水平與(yu)GF-Ctrl組不同。代(dai)謝和(he)(he)能量(liang)控制(zhi)的(de)(de)AMPK信(xin)號通路(lu)是(shi)唯一同時富含蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質組和(he)(he)DNA甲(jia)基(ji)(ji)組的(de)(de)共同通路(lu)，表(biao)明(ming)(ming)AMPK通路(lu)在(zai)(zai)P. copri 的(de)(de)促(cu)癌作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)中(zhong)起著(zhu)重要(yao)作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)。用(yong)(yong)(yong)P. copri 處理后，AMPK的(de)(de)磷酸化(hua)(hua)明(ming)(ming)顯受到抑(yi)制(zhi)。綜上(shang)所述(shu)，蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質組和(he)(he)DNA甲(jia)基(ji)(ji)組都表(biao)明(ming)(ming)，UHRF1調(diao)控的(de)(de)DNA甲(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)致(zhi)使代(dai)謝和(he)(he)能量(liang)控制(zhi)的(de)(de)AMPK信(xin)號通路(lu)失活，這(zhe)在(zai)(zai)P. copri 促(cu)進癌癥的(de)(de)過程中(zhong)起著(zhu)重要(yao)的(de)(de)作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)。

Fig.4：P. copri 調控4T1腫(zhong)瘤蛋白(bai)譜(pu)

Fig.5：P. copri 改變了4T1腫瘤的DNA甲基化譜(pu)

4.P. copri 會耗盡宿主體(ti)內抑制腫瘤生長的(de)吲哚-3-丙酮酸(IPyA)

利用(yong)超(chao)高效液相色譜-串(chuan)聯質譜儀(UPLC-MS/MS)對(dui)(dui)(dui)血清中(zhong)(zhong)約200種(zhong)代(dai)謝物(wu)(wu)進(jin)行了定量(liang)化。結果表明(ming)，P. copri 處(chu)理(li)組中(zhong)(zhong)各種(zhong)代(dai)謝物(wu)(wu)的(de)相對(dui)(dui)(dui)豐度與(yu)非(fei)處(chu)理(li)組有(you)顯著差(cha)異。在(zai)SPF-Ctrl組和(he)(he)SPF-P組之間的(de)比(bi)較中(zhong)(zhong)，46種(zhong)差(cha)異代(dai)謝產物(wu)(wu)被確定為(wei)潛在(zai)的(de)生物(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)，而在(zai)GF-Ctrl組和(he)(he)GF-P組之間的(de)比(bi)較中(zhong)(zhong)，有(you)39種(zhong)潛在(zai)的(de)生物(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)。此(ci)外(wai)，SPF-P組和(he)(he)GFP組的(de)富(fu)馬(ma)酸(suan)(suan)、氧戊二(er)酸(suan)(suan)、氧己(ji)二(er)酸(suan)(suan)和(he)(he)吲哚-3-丙(bing)酮酸(suan)(suan)(IPyA)含(han)(han)量(liang)均顯著低于(yu)其對(dui)(dui)(dui)應組。P. copri 處(chu)理(li)顯著降低了IPyA和(he)(he)色氨酸(suan)(suan)(Trp)含(han)(han)量(liang)。進(jin)一(yi)步驗證表明(ming)，P. copri 可以(yi)消耗(hao)Trp，口服P. copri 促進(jin)腫瘤(liu)生長(chang)(chang)的(de)同時伴隨著IPyA的(de)急劇減少(shao)，推(tui)測(ce)IPyA可能是宿主(zhu)體內(nei)的(de)一(yi)種(zhong)固(gu)有(you)的(de)細胞(bao)毒性代(dai)謝物(wu)(wu)。體外(wai)實驗結果表明(ming)，IPyA對(dui)(dui)(dui)乳腺癌細胞(bao)增殖和(he)(he)集(ji)落形成均有(you)抑制作(zuo)用(yong)。IPyA還顯著抑制正常(chang)結腸上皮細胞(bao)和(he)(he)宮(gong)頸癌細胞(bao)增殖。綜(zong)上所述，P. copri 促進(jin)腫瘤(liu)生長(chang)(chang)主(zhu)要依賴于(yu)從(cong)Trp中(zhong)(zhong)耗(hao)盡(jin)IPyA。

Fig.6：P. copri 調節(jie)宿主(zhu)的(de)代謝(xie)物，耗盡內在的(de)抗癌IPyA

Fig.7 IPyA對4T1細(xi)胞(bao)具(ju)有細(xi)胞(bao)毒性

5.IPyA通過抑制UHRF1介導的負調控激活(huo)AMPK抑制細(xi)胞增殖

最后(hou)本(ben)文探(tan)討了IPyA對4T1細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)毒作(zuo)用(yong)機制(zhi)(zhi)。結果(guo)表(biao)(biao)明，當表(biao)(biao)現出細(xi)胞(bao)毒性時，IPyA下調UHRF1、DMMT3A和DNMT1的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達，促(cu)(cu)進(jin)AMPK磷(lin)酸(suan)化(hua)(hua)，同時上調總mTOR和ULK1的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達。此外，IPyA增(zeng)加了CFTR啟(qi)動子甲基(ji)化(hua)(hua)，這(zhe)些(xie)結果(guo)與P. copri 對腫瘤蛋(dan)白質譜和DNA甲基(ji)化(hua)(hua)變化(hua)(hua)的(de)(de)(de)影(ying)響正(zheng)好相反(fan)，表(biao)(biao)明IPyA耗竭在P. copri 促(cu)(cu)進(jin)腫瘤發(fa)展(zhan)過程中(zhong)起關鍵作(zuo)用(yong)。本(ben)研(yan)究發(fa)現IPyA抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)了細(xi)胞(bao)核(he)內UHRF1和PP2A C的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達，隨后(hou)增(zeng)加了AMPK的(de)(de)(de)磷(lin)酸(suan)化(hua)(hua)，且(qie)IPyA抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)了UHRF1的(de)(de)(de)轉錄，這(zhe)與抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)UHRF1蛋(dan)白的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達一致(zhi)，表(biao)(biao)明轉染UHRF1報告基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)4T1細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)熒光(guang)素酶活性降低(di)。根據OCR和ECAR的(de)(de)(de)結果(guo)，可以計算出由線粒(li)體氧(yang)化(hua)(hua)磷(lin)酸(suan)化(hua)(hua)(mitoATP)和糖(tang)酵解(jie)(glyATP)產生(sheng)的(de)(de)(de)ATP大幅減(jian)少(shao)，導(dao)致(zhi)總ATP的(de)(de)(de)產生(sheng)明顯減(jian)少(shao)。在IPyA處理下，mitoATP在總ATP生(sheng)成中(zhong)所(suo)占的(de)(de)(de)比(bi)例顯著(zhu)降低(di)，而(er)glyATP所(suo)占的(de)(de)(de)比(bi)例更高(gao)，這(zhe)是(shi)AMPK活化(hua)(hua)的(de)(de)(de)典型結果(guo)。

為了(le)進(jin)一步(bu)證實P. copri 對乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)進(jin)展(zhan)的(de)(de)促(cu)進(jin)作(zuo)用，本(ben)文還(huan)研究(jiu)了(le)P. copri 在另一種小(xiao)鼠乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)細(xi)胞株EMT6誘導的(de)(de)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)模型中(zhong)的(de)(de)作(zuo)用，以及(ji)IPyA對該(gai)細(xi)胞的(de)(de)影響。正(zheng)如預期的(de)(de)那樣，口服P. copri 使EMT6腫(zhong)瘤生長更快，并且P. copri 組的(de)(de)小(xiao)鼠腫(zhong)瘤重量(liang)顯著高(gao)于未(wei)處理組。與(yu)在4T1細(xi)胞中(zhong)的(de)(de)發現結果類似，在P. copri 處理的(de)(de)小(xiao)鼠中(zhong)，UHRF1上調(diao)，而AMPK的(de)(de)磷酸化(hua)受到抑(yi)制。IPyA抑(yi)制EMT6細(xi)胞的(de)(de)增殖和集(ji)落形成(cheng)，下調(diao)UHRF1的(de)(de)表(biao)達，但(dan)促(cu)進(jin)AMPK的(de)(de)磷酸化(hua)。

綜(zong)上所述，IPyA通過抑制UHRF1介導的(de)負(fu)調控激活AMPK，重(zhong)(zhong)新編程(cheng)細胞能量(liang)穩態，最終抑制細胞增(zeng)殖，IPyA的(de)顯著減少(shao)對(dui)于P. copri 促(cu)進乳(ru)腺癌具有根本的(de)重(zhong)(zhong)要意義。

Fig.8 IPyA通過(guo)抑制UHRF1介導的負(fu)調控(kong)來激活AMPK

Fig.9 P. corpi 促進(jin)EMT6腫瘤生長，而IPyA對4T1細胞具有細胞毒性

P. copri 是(shi)(shi)乳(ru)腺癌(ai)(ai)患者腸(chang)道微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)中(zhong)的(de)(de)(de)一種顯著(zhu)富(fu)集和(he)(he)普遍存(cun)在(zai)的(de)(de)(de)細菌，可能成為乳(ru)腺癌(ai)(ai)進(jin)展的(de)(de)(de)一個新的(de)(de)(de)風(feng)險(xian)因(yin)素。通過多組學和(he)(he)大量(liang)驗(yan)證實驗(yan)表(biao)明，過量(liang)的(de)(de)(de)P. copri 消耗(hao)了(le)(le)大量(liang)的(de)(de)(de)Trp，從(cong)而(er)阻礙(ai)了(le)(le)IPyA在(zai)宿(su)主中(zhong)的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)理(li)積累。IPyA在(zai)生(sheng)(sheng)理(li)水平上是(shi)(shi)宿(su)主體內的(de)(de)(de)一種內源(yuan)性抗(kang)癌(ai)(ai)物(wu)(wu)質(zhi)，IPyA可以直接(jie)抑(yi)制(zhi)(zhi)UHRF1的(de)(de)(de)轉錄，進(jin)而(er)減(jian)少(shao)細胞核內UHRF1和(he)(he)PP2A C，從(cong)而(er)促進(jin)AMPK的(de)(de)(de)磷酸化，這(zhe)與P. copri 的(de)(de)(de)促癌(ai)(ai)作用正好相反。因(yin)此，過量(liang)的(de)(de)(de)P. copri 對IPyA的(de)(de)(de)耗(hao)竭加(jia)強了(le)(le)UHRF1介導的(de)(de)(de)負調控作用，使能量(liang)控制(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)AMPK信號通路失活，從(cong)而(er)促進(jin)腫瘤生(sheng)(sheng)長(chang)。本研究結(jie)果首(shou)次強調了(le)(le)P. copri 是(shi)(shi)乳(ru)腺癌(ai)(ai)發生(sheng)(sheng)和(he)(he)發展進(jin)程中(zhong)的(de)(de)(de)一個危(wei)險(xian)因(yin)素，為后續的(de)(de)(de)機(ji)制(zhi)(zhi)探(tan)索和(he)(he)臨床研究提供了(le)(le)新的(de)(de)(de)思路！