潰瘍(yang)性結腸(chang)(chang)炎(UC)是一種復雜的、動(dong)態的胃腸(chang)(chang)道(dao)疾病，UC的一個關(guan)鍵標(biao)志(zhi)是腸(chang)(chang)道(dao)菌群(qun)組成的改變，專注于恢復腸(chang)(chang)道(dao)菌群(qun)平衡(heng)的策略是治療干預的關(guan)鍵方面。

近年(nian)來，益生菌(jun)胞外囊泡(EVs)在生物醫學上的(de)(de)(de)應(ying)用引起了(le)(le)人們的(de)(de)(de)極大興趣。最近的(de)(de)(de)報道(dao)強調了(le)(le)植物乳桿(gan)菌(jun)衍生的(de)(de)(de)EV的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)調節和(he)抗炎作用，表(biao)明了(le)(le)解這些(xie)EV在形(xing)成(cheng)免(mian)疫(yi)反應(ying)中的(de)(de)(de)作用是很重(zhong)要(yao)的(de)(de)(de)。此外，益生菌(jun)EVs除(chu)了(le)(le)影(ying)響免(mian)疫(yi)應(ying)答(da)外，還具有調節腸(chang)道(dao)菌(jun)群和(he)糾正(zheng)腸(chang)道(dao)疾病的(de)(de)(de)雙(shuang)重(zhong)作用。

本研究探討了L. plantarum UJS001 (LP-UJS)衍生EV ((LP-UJS-EVs)緩解UC的(de)機制。根(gen)據我們的(de)研究結果(guo)，LP-UJS-EV治(zhi)療促進腸道(dao)屏障的(de)修復(fu)，誘導巨噬(shi)細胞M2極化，上調白細胞介(jie)素-10 (IL-10)和轉化生長(chang)因(yin)子(zi)β (TGF-β)調節(jie)腸道(dao)菌群組成，影響賴(lai)氨酸代(dai)謝途(tu)徑。對EVs作用的(de)探索為益生菌特別是其囊泡(pao)成分(fen)在UC治(zhi)療中(zhong)的(de)應用提供了一(yi)個新(xin)的(de)視(shi)角。

1.LP-UJS的純化(hua)、鑒(jian)定及表征

本研究對菌(jun)株進行(xing)了初(chu)步純化和鑒定。利用特(te)異性引物擴(kuo)增(zeng)分離菌(jun)株的(de)16S rDNA，發現分離菌(jun)株與(yu)(yu)L的(de)相似性為99%。此(ci)(ci)外，系(xi)統發育樹顯示(shi)，菌(jun)株LP-UJS001與(yu)(yu)L. plantarum在同(tong)一分支，因此(ci)(ci)被鑒定為L. plantarum(圖(tu)1D)。隨后(hou)，從(cong)LP-UJS培養(yang)上(shang)清(qing)液中通過(guo)過(guo)濾濃縮(FC)聯合(he)超離心分離出EV。觀(guan)察到，LP-UJS-EV為球(qiu)形雙層膜結構(圖(tu)1E)，帶負(fu)電荷(圖(tu)1F)，此(ci)(ci)外，以每1010個(ge)顆(ke)粒3mg /mL的(de)濃度(du)檢測LP-UJS-EV蛋白(圖(tu)1G)。經FC和離心處理后(hou)，獲得更高(gao)濃度(du)的(de)EV(圖(tu)1H)。

圖(tu)1：LP-UJS的純化和鑒定

2.LP-UJS-EVs促進腸上皮細(xi)胞生長和(he)巨噬細(xi)胞M2極化

為了探討不同濃度的LP-UJS-EVs在炎癥條件下(xia)對正常腸(chang)上皮細胞(bao)活性(xing)和(he)巨噬細胞(bao)極(ji)化的影(ying)響。研究(jiu)結果顯示，LP-UJS-EVs促進HCoEpiC和(he)IEC-6細胞(bao)的生長呈濃度依賴性(xing)，并且(qie)根(gen)據巨噬細胞(bao)M2標志物CD163、IL-10、TGF-β 的mRNA水平(ping)變(bian)化量，確認了在0.3 mg/mL時效果最顯著(zhu)(P < 0.05)（圖(tu)2）。

圖(tu)2：LP-UJS-EVs促進腸上皮細胞生長和巨噬細胞m2極化

3.LP-UJS-EVs減輕DSS誘導的(de)小鼠UC

為了研究LP-UJS-EVs對UC的影響(xiang)，通過1周DSS誘導(dao)建立UC模型(xing)，并在模型(xing)建立后開始治療(圖3A)。

根據體(ti)重(zhong)(zhong)變化(hua)評分(fen)，DAI和(he)結腸(chang)長(chang)度評估小(xiao)鼠(shu)(shu)UC程(cheng)度。從第5天(tian)到(dao)第10天(tian)，其他三(san)組(zu)小(xiao)鼠(shu)(shu)的(de)(de)體(ti)重(zhong)(zhong)均較對照(zhao)組(zu)下降，其中(zhong)DSS組(zu)體(ti)重(zhong)(zhong)下降最明顯(xian)(P < 0.0001)。從第11天(tian)到(dao)第14天(tian)，LP-UJS組(zu)和(he)LP-UJS- EV組(zu)小(xiao)鼠(shu)(shu)體(ti)重(zhong)(zhong)逐漸增加(jia)(P < 0.001)(圖3B)，其中(zhong)LP-UJS- EV組(zu)小(xiao)鼠(shu)(shu)體(ti)重(zhong)(zhong)增加(jia)更為顯(xian)著(P < 0.05)。此外，DSS組(zu)的(de)(de)DAI評分(fen)高于(yu)其他三(san)組(zu)。值得注意的(de)(de)是，LP-UJS-EVs組(zu)DAI評分(fen)略低于(yu)LPUJS組(zu)(P < 0.05)(圖3C)。

以上結果(guo)表明，LP-UJS和(he)LP-UJS- ev均能有(you)效(xiao)治療UC，且LP-UJS- ev效(xiao)果(guo)優于LPUJS。

圖3：LP-UJS-EVs可減輕DSS誘導的小鼠UC

4.LP-UJS-EVs修復UC小鼠腸(chang)道(dao)屏障

本研究(jiu)為(wei)了評(ping)估和比較LP-UJS-EVs處理對DSS誘導(dao)UC小鼠腸道(dao)屏障的影響，采(cai)用HE和Alcian染色進行組(zu)織學分(fen)析。

結果顯(xian)(xian)示，P-UJS和(he)LP-UJS-EVs均能(neng)(neng)顯(xian)(xian)著恢復UC小鼠杯狀細胞的數(shu)量，改善結構破壞，減(jian)少炎癥細胞的浸潤（圖4A）。此(ci)外，免(mian)疫組化染色結果顯(xian)(xian)示，LPUJS和(he)LP-UJS-EVs均能(neng)(neng)恢復ZO-1、cludin -1和(he)ALPI的表(biao)達，修復組織損傷，且LP-UJS-EVs效果優于(yu)(yu)(yu)LP-UJS (P < 0.01)（圖4B）。血清(qing)FITC -葡(pu)聚糖4 (FD4)濃(nong)度(du)表(biao)明，LP-UJS和(he)LP-UJS-EVs均能(neng)(neng)顯(xian)(xian)著降低(di)DSS引起的腸黏膜通(tong)透性增加(P < 0.01)(圖4C)。LP-UJS-EVs組大鼠血清(qing)IL-10、TGF-β濃(nong)度(du)顯(xian)(xian)著高于(yu)(yu)(yu)DSS組(P < 0.01)。LP-UJS-EVs組IL-6、TNF-α、組胺水平明顯(xian)(xian)低(di)于(yu)(yu)(yu)DSS組(P < 0.05)(圖4D-H)

綜(zong)上，LP-UJS和LP-UJS-EVs在降低炎(yan)癥(zheng)引(yin)起的腸(chang)通透性(xing)增(zeng)加、修復腸(chang)黏(nian)膜(mo)結構、抑制炎(yan)癥(zheng)進展等方面均有顯著作用。并(bing)且LP-UJS-EVs的效(xiao)果優于LP-UJS。

圖(tu)4：LP-UJS-EVs修復(fu)UC小鼠腸道屏障

5.LP-UJS-EVs通過驅(qu)動巨(ju)噬細胞M2極(ji)化(hua)減輕(qing)腸道炎癥(zheng)

觀察(cha)到(dao)LP-UJS-EVs對DSS誘導的 UC小鼠的治(zhi)療(liao)作(zuo)用與(yu)免疫應答之間的相關(guan)性，并觀察(cha)到(dao)LP-UJS-EVs治(zhi)療(liao)UC小鼠MLNs中CD4+/CD8+ T細(xi)胞(bao)比例降低的逆轉(zhuan)(P < 0.05)(圖(tu)5A)。與(yu)DSS組相比，LP-UJS組和LP-UJS- ev組Treg細(xi)胞(bao)比例均降低(P < 0.01)。

進一步分析(xi)巨(ju)(ju)噬(shi)細胞比(bi)例(li)，DSS組M1巨(ju)(ju)噬(shi)細胞較(jiao)對(dui)照(zhao)組顯著(zhu)增(zeng)加(P < 0.05)。LP-UJS和LP-UJS- ev治療后，M1巨(ju)(ju)噬(shi)細胞比(bi)例(li)顯著(zhu)降低(P < 0.01)，且LP-UJS- ev組比(bi)LP-UJS組下(xia)降更(geng)(geng)明顯。相比(bi)于DSS組，CD163+ M2巨(ju)(ju)噬(shi)細胞的(de)(de)(de)比(bi)例(li)LP-UJS組和LP-UJS- EV組均(jun)顯著(zhu)升高(gao)(P < 0.01)，其中LP-UJS- ev組升高(gao)更(geng)(geng)為(wei)明顯(P < 0.001)。值得注(zhu)意(yi)的(de)(de)(de)是，LP-UJS-EVs組M2巨(ju)(ju)噬(shi)細胞的(de)(de)(de)比(bi)例(li)與(yu)對(dui)照(zhao)組相比(bi)增(zeng)加了(le)約6倍，與(yu)DSS組相比(bi)增(zeng)加了(le)近3倍。這強調(diao)了(le)驅動巨(ju)(ju)噬(shi)細胞M2極化是LP-UJS-EVs減輕UC小鼠炎癥的(de)(de)(de)關鍵機(ji)制，且LP-UJS-EVs的(de)(de)(de)效果優(you)于LP-UJS (P < 0.05)(圖(tu)5C)。

圖(tu)5：LP-UJS-EVs通過(guo)驅動巨(ju)噬細胞(bao)M2極化(hua)減輕腸(chang)道炎癥

6.LP-UJS-EVs對(dui)UC小鼠腸道菌群(qun)組成的影響

在確定了LP-UJS-EVs的(de)(de)免疫調節作用后，本研(yan)究(jiu)試圖通(tong)過16S rRNA基因序列(lie)分析(xi)(xi)(xi)來研(yan)究(jiu)它們對(dui)UC小鼠腸道(dao)微生物群的(de)(de)潛(qian)在影響。擬桿菌門(men)(men)和(he)厚壁菌門(men)(men)是(shi)(shi)(shi)小鼠腸道(dao)中(zhong)相(xiang)(xiang)(xiang)對(dui)豐度(du)最(zui)高的(de)(de)兩個門(men)(men)。與(yu)其他三組(zu)相(xiang)(xiang)(xiang)比，DSS組(zu)Bacteroidetes與(yu)Firmicutes的(de)(de)比例最(zui)低，Verrucomicrobia的(de)(de)相(xiang)(xiang)(xiang)對(dui)豐度(du)最(zui)高，而LP-UJS-EVs組(zu)Chloroflexi的(de)(de)相(xiang)(xiang)(xiang)對(dui)豐度(du)最(zui)高(圖6A)。其次，通(tong)過β-多(duo)樣(yang)性(xing)分析(xi)(xi)(xi)分析(xi)(xi)(xi)不同組(zu)間(jian)的(de)(de)多(duo)樣(yang)性(xing)差異(yi)。基于Bray - Curtis指數的(de)(de)主坐標分析(xi)(xi)(xi)(PCoA)表明，DSS組(zu)與(yu)LP-UJS和(he)LP-UJS-EVs組(zu)有(you)顯著差異(yi)。PC1占總變化的(de)(de)29.8%，PC2占16.1%(圖6B)。此(ci)外，非度(du)量多(duo)維(wei)尺度(du)(NMDS)顯示出(chu)與(yu)PCoA結果相(xiang)(xiang)(xiang)似的(de)(de)結果，應(ying)力值(zhi)為0.091(圖6C)。值(zhi)得注(zhu)意的(de)(de)是(shi)(shi)(shi)，當(dang)應(ying)力小于0.2時，NMDS分析(xi)(xi)(xi)結果被廣泛認為是(shi)(shi)(shi)更可(ke)靠的(de)(de)。因此(ci)，PCoA和(he)NMDS分析(xi)(xi)(xi)都是(shi)(shi)(shi)可(ke)靠的(de)(de)。

物種組(zu)成(cheng)(cheng)熱(re)圖上看(kan)，DSS組(zu)Coprococcus、parabobacteroides、Staphylococcus、Odoribacter、Allobaculum和(he)Turicibacter的豐(feng)度(du)顯(xian)著高(gao)于對照組(zu)(P < 0.05)。LP-UJS-EVs治療導致Coprococcus、parabobacteroides、Staphylococcus和(he)Allobaculum豐(feng)度(du)顯(xian)著下降，恢復了與對照組(zu)相似的組(zu)成(cheng)(cheng)形(xing)式(shi)(圖6D,E)。

根據(ju)(ju)細菌(jun)(jun)標(biao)記基(ji)因單(dan)獨(du)測(ce)序數據(ju)(ju)進一步(bu)預測(ce)功能單(dan)元(yuan)組(zu)成(cheng)(cheng)，發現最豐(feng)(feng)富(fu)的(de)(de)三個功能通路(lu)是核苷(gan)和(he)核苷(gan)酸生物(wu)合(he)成(cheng)(cheng)、氨基(ji)酸生物(wu)合(he)成(cheng)(cheng)以及輔因子、假(jia)基(ji)、電子載體和(he)維生素生物(wu)合(he)成(cheng)(cheng)(圖(tu)6G)。為了研(yan)究腸道菌(jun)(jun)群、炎癥物(wu)質和(he)M1/M2巨(ju)噬細胞標(biao)志物(wu)蛋白(bai)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)之間的(de)(de)潛(qian)在(zai)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)(guan)性，相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)(guan)性分析結果顯示，Prevotella和(he)Clostridiaceae_Clostridium的(de)(de)豐(feng)(feng)度與(yu)(yu)TNF-α和(he)CD86的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)呈(cheng)負相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)(guan)(P < 0.05)， AF12的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)與(yu)(yu)TNF-α呈(cheng)負相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)(guan)(P < 0.05)。相(xiang)(xiang)反，副擬桿菌(jun)(jun)的(de)(de)豐(feng)(feng)度與(yu)(yu)組(zu)胺、IL-6、TNF-α、CD86的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)呈(cheng)正(zheng)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)(guan)(P < 0.05)，異桿菌(jun)(jun)與(yu)(yu)組(zu)胺、IL-6的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)呈(cheng)正(zheng)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)(guan)(P < 0.05)，糞球菌(jun)(jun)與(yu)(yu)IL-6、TNF-α的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)呈(cheng)正(zheng)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)(guan)(P < 0.05)， Turicibacter與(yu)(yu)TNF-α的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)呈(cheng)正(zheng)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)(guan)(P < 0.05)(圖(tu)6F)。

圖(tu)6：LP-UJS-EVs對UC小鼠腸道菌群組成的影(ying)響

7.LP-UJS-EVs影響UC小鼠糞便代(dai)謝組(zu)學

為了(le)闡明LP-UJS-EVs對UC小鼠代謝的潛在影(ying)響，對小鼠糞(fen)便樣本(ben)進(jin)行了(le)非靶代謝組(zu)學檢測(ce)，通(tong)過對LP-UJS組(zu)和DSS組(zu)之間以及(ji)LP-UJS- ev組(zu)和DSS組(zu)之間差異(yi)代謝物的富集分析(xi)，發(fa)現通(tong)路賴氨(an)酸降解是兩個(ge)比較組(zu)中(zhong)最關鍵(jian)的共(gong)同代謝通(tong)路(圖7B,C)。

此外(wai)，兩(liang)個比(bi)較組共有13個共同差異代謝物，其中(zhong)上調(diao)4個，下調(diao)9個(P < 0.05, VIP > 1, fold change >2或<0.5)(圖7D)。在(zai)兩(liang)組的13種共有差異代謝物中(zhong)，LP-UJS和(he)LP-UJS-EV處理顯(xian)著提高了(le)1-棕(zong)櫚酰(xian)甘油(you)磷膽(dan)堿、3-酮鞘醇(chun)(chun)、氧己酸、香草扁桃(tao)酸、n1乙酰(xian)亞精(jing)胺、3-羥(qian)基芐(xia)基醇(chun)(chun)糖苷、12OPDA、25-羥(qian)基膽(dan)固醇(chun)(chun)和(he)GMP水平(P < 0.05)。相反，別嘌呤醇(chun)(chun)、甲氧二烯、二十(shi)二碳六烯酸和(he)氯氰菊酯水平明顯(xian)下調(diao)(P < 0.05)。

腸道微(wei)生物菌(jun)(jun)群與(yu)代謝(xie)物之間的相關性分析結果顯示，葡萄球(qiu)菌(jun)(jun)與(yu)n1 -乙酰精(jing)胺(an)和氧己二酸呈(cheng)負(fu)相關(P < 0.05)(圖7F)。這些發(fa)現強調了葡萄球(qiu)菌(jun)(jun)和腸道代謝(xie)物(如(ru)n -乙酰精(jing)胺(an)和氧己二酸)在UC小鼠炎癥發(fa)病機(ji)制(zhi)中的重要作(zuo)用。

圖7：LP-UJS-EVs對UC小(xiao)鼠(shu)糞便(bian)代謝(xie)水平的影(ying)響

最近的研(yan)(yan)究(jiu)表明，多種乳桿菌(jun)種類分泌的EV可(ke)以促進動物(wu)(wu)模型炎癥性腸病(bing)的恢(hui)復。植物(wu)(wu)EVs在(zai)體外實(shi)驗中可(ke)誘(you)導(dao)巨噬細(xi)胞M2極化(hua)(hua)22，但在(zai)體內是否也能誘(you)導(dao)巨噬細(xi)胞M2極化(hua)(hua)尚無文獻報道(dao)。在(zai)這(zhe)項研(yan)(yan)究(jiu)中。作者(zhe)全面從體內和體外研(yan)(yan)究(jiu)揭示了LP-UJS-EVs在(zai)協調巨噬細(xi)胞向M2表型極化(hua)(hua)和調節免(mian)疫反應方面的實(shi)質性影響。

UC的(de)發展與腸道微生物(wu)群(qun)多樣性的(de)減少和(he)(he)病原體豐(feng)(feng)度的(de)增加(jia)有(you)著復(fu)雜(za)的(de)聯系(xi)，本研(yan)究，將特定細菌(jun)(jun)與炎癥標志物(wu)聯系(xi)起來的(de)相關性分(fen)析為腸道生態系(xi)統內(nei)復(fu)雜(za)的(de)相互作用網絡(luo)提供了有(you)價值(zhi)的(de)見解，LP-UJS-EVs選擇性影響(xiang)益(yi)生菌(jun)(jun)和(he)(he)致病菌(jun)(jun)豐(feng)(feng)度的(de)能力為靶向治(zhi)療干預開辟了道路，并為UC治(zhi)療提供了個性化(hua)的(de)方法。

一些研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)證(zheng)(zheng)明，腸(chang)道菌(jun)群(qun)在人體(ti)賴(lai)氨(an)酸(suan)代(dai)(dai)謝(xie)中起著(zhu)重(zhong)要(yao)作用(yong)，本研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)也驗(yan)證(zheng)(zheng)了(le)這一結(jie)論(lun)，并(bing)且通過(guo)微(wei)生(sheng)物(wu)菌(jun)群(qun)和(he)代(dai)(dai)謝(xie)組(zu)相關性分析，發(fa)現了(le)差(cha)異代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)n1 -乙酰(xian)精(jing)胺(an)與(yu)葡萄球菌(jun)之間呈現顯著(zhu)負相關，n1 -乙酰(xian)精(jing)胺(an)在治(zhi)(zhi)療(liao)結(jie)腸(chang)炎(yan)和(he)增強對癌(ai)癥(包括結(jie)腸(chang)癌(ai))的抵抗力方面具有顯著(zhu)的治(zhi)(zhi)療(liao)作用(yong)。經LP-UJS-EVs治(zhi)(zhi)療(liao)后，觀察到n1 -乙酰(xian)精(jing)胺(an)水平顯著(zhu)升高，這間接證(zheng)(zheng)實了(le)腸(chang)道微(wei)生(sheng)物(wu)群(qun)組(zu)成和(he)代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)的調節是(shi)LP-UJS-EVs發(fa)揮其治(zhi)(zhi)療(liao)作用(yong)的關鍵途徑(jing)。

總(zong)體(ti)而言，本研究(jiu)在(zai)EV水平(ping)上對LP-UJS治療(liao)UC的機(ji)制有了(le)全面的了(le)解，此外，LP-UJS-EVs與氧己二酸和巨噬細(xi)胞極化(hua)之間(jian)的關聯為進一步(bu)探索(suo)開辟(pi)了(le)道(dao)路，并可能為治療(liao)腸道(dao)炎癥(zheng)性疾病的創新治療(liao)策略提供新的途(tu)徑。