2024-07-21
文章(zhang)題目：Late gestational exposure to fenvalerate impacts ovarian reserve in neonatal mice via YTHDF2-mediated P-body assembly 重慶醫科(ke)大學(xue)在(zai)《Science of the Total Environment》上(shang)(shang)發表了妊娠(shen)后期(qi)暴露于氰戊菊酯通過YTHDF2介導的p小體組(zu)裝影響新生小鼠(shu)卵巢(chao)儲備的研(yan)(yan)究成果。本研(yan)(yan)究中轉(zhuan)錄(lu)組(zu)檢測及(ji)部分數(shu)據分析工作由上(shang)(shang)海派(pai)森諾(nuo)生物科(ke)技股份有限(xian)公(gong)司完成。
01、研究背景 氰戊(wu)菊酯（FEN）是(shi)一種具(ju)有雌激(ji)素樣活性(xing)的(de)環(huan)境內(nei)分泌干擾物(wu)（EDC），對卵巢(chao)功能(neng)有不良影(ying)(ying)響(xiang)。此外，女性(xing)尿液中FEN代謝物(wu)的(de)存(cun)在(zai)(zai)與原發(fa)性(xing)卵巢(chao)功能(neng)不全（POI）的(de)風險呈正(zheng)相關。在(zai)(zai)哺乳(ru)動物(wu)中，生(sheng)命早期建(jian)立(li)的(de)原始(shi)卵泡池作為儲存(cun)庫，在(zai)(zai)整個(ge)雌性(xing)生(sheng)殖(zhi)生(sheng)命中儲存(cun)所(suo)有可(ke)用的(de)卵母細胞。原始(shi)卵泡池的(de)初始(shi)大小及其耗(hao)盡率(lv)影(ying)(ying)響(xiang)POI的(de)發(fa)生(sheng)。然(ran)而，關于FEN暴露對原始(shi)卵泡發(fa)生(sheng)影(ying)(ying)響(xiang)的(de)研(yan)究非(fei)常有限(xian)。
02、研究方法 材料：CD1小鼠(shu) 處理(li)：將妊娠小鼠(shu)（F0）隨機分為(wei)4組(zu)(zu)，分別為(wei)FEN給藥0.2、2.0、20.0 mg/kg-bw/d組(zu)(zu)及(ji)對(dui)照(zhao)組(zu)(zu)，分娩后第(di)1天(tian)和(he)第(di)5天(tian)分離(li)新生(sheng)兒(er)小鼠(shu)（F1）卵巢(chao)，同時，在相(xiang)同條件下培養(yang)F1雌性小鼠(shu)至(zhi)8周齡，分離(li)卵巢(chao)和(he)血清。 技術：RNA-seq、IP-MS、Western-Blot等
03、技術路線
03、研究結果 1、妊娠晚期暴露于FEN會損害新生(sheng)小鼠的原始卵泡(pao)形成 在交配后(hou)16.5 - 18.5天(tian)（dpc）連續(xu)3天(tian)灌喂0.2、2.0和20.0 mg/kg的(de)(de)(de)FEN，并在分娩后(hou)1天(tian)（1dd）采集新生(sheng)兒卵(luan)(luan)(luan)巢(chao)(chao)。與對照組(zu)(zu)相比(bi)，2.0和20.0 mg/kg FEN組(zu)(zu)中(zhong)(zhong)(zhong)出(chu)現大量的(de)(de)(de)生(sheng)殖細(xi)(xi)胞(bao)囊腫，FEN組(zu)(zu)卵(luan)(luan)(luan)巢(chao)(chao)總卵(luan)(luan)(luan)母(mu)細(xi)(xi)胞(bao)數(shu)量顯(xian)(xian)著(zhu)增加。5dd后(hou)，囊腫卵(luan)(luan)(luan)母(mu)細(xi)(xi)胞(bao)幾(ji)乎消失，與對照組(zu)(zu)相比(bi)，2.0和20.0 mg/kg FEN組(zu)(zu)的(de)(de)(de)原(yuan)始卵(luan)(luan)(luan)泡數(shu)量與總卵(luan)(luan)(luan)母(mu)細(xi)(xi)胞(bao)數(shu)量顯(xian)(xian)著(zhu)減少。通過Western-Blot檢(jian)測凋亡調節因子BAX和BCL2的(de)(de)(de)表達(da)。結(jie)果(guo)顯(xian)(xian)示，與對照組(zu)(zu)相比(bi)，兩個FEN組(zu)(zu)1dpp小(xiao)(xiao)鼠卵(luan)(luan)(luan)巢(chao)(chao)中(zhong)(zhong)(zhong)BAX/BCL2的(de)(de)(de)比(bi)值(zhi)顯(xian)(xian)著(zhu)降低，表明(ming)1dpp小(xiao)(xiao)鼠的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)凋亡受到抑制(zhi)。在5dpp卵(luan)(luan)(luan)巢(chao)(chao)中(zhong)(zhong)(zhong)，BAX/BCL2的(de)(de)(de)比(bi)例(li)在所有組(zu)(zu)中(zhong)(zhong)(zhong)表現出(chu)一致的(de)(de)(de)模式，表明(ming)持續(xu)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)凋亡（圖1）。這(zhe)些結(jie)果(guo)表明(ming)，妊娠后(hou)期暴露于FEN會破壞原(yuan)始卵(luan)(luan)(luan)泡形(xing)成并損害卵(luan)(luan)(luan)巢(chao)(chao)初始儲備。 圖1 FEN可破(po)壞新生兒卵巢(chao)的(de)原始卵泡形成 2、FEN增加(jia)新生(sheng)兒卵巢(chao)中m6A水(shui)平(ping)和YTHDF2表達水(shui)平(ping) Dot-Blot和IHC結果(guo)顯示，2.0和20.0 mg/kg FEN組(zu)1dpp卵(luan)巢(chao)(chao)中RNA的(de)(de)總體(ti)m6A水(shui)平(ping)顯著(zhu)高(gao)(gao)(gao)于(yu)對照組(zu)。Western-Blot分(fen)析檢測了m6A甲基化轉移酶METTL3、m6A去甲基化酶ALKBH5和m6A甲基化閱(yue)讀蛋白（YTHDF2等）的(de)(de)表達。與對照組(zu)相比，兩組(zu)1dpp卵(luan)巢(chao)(chao)中METTL3、YTHDF2水(shui)平(ping)顯著(zhu)升(sheng)高(gao)(gao)(gao)，而各組(zu)間ALKBH5的(de)(de)表達沒(mei)有顯著(zhu)變化。此外，兩種劑量(liang)的(de)(de)FEN暴(bao)(bao)露均導(dao)致囊腫(zhong)卵(luan)母(mu)細(xi)胞(bao)細(xi)胞(bao)質中YTHDF2的(de)(de)顯著(zhu)積累。Western-Blot和IF進一步證實，在16.5 dpc至5 dpp期間，YTHDF2主要存在于(yu)卵(luan)巢(chao)(chao)囊腫(zhong)的(de)(de)卵(luan)母(mu)細(xi)胞(bao)以及卵(luan)泡中，提示其在早期卵(luan)子發生中起調節作用（圖2）。上述結果(guo)表明，妊娠后期暴(bao)(bao)露于(yu)FEN可導(dao)致新生兒卵(luan)巢(chao)(chao)中m6A水(shui)平(ping)升(sheng)高(gao)(gao)(gao)，YTHDF2表達升(sheng)高(gao)(gao)(gao)。 圖2 暴(bao)露于FEN對1dpp卵巢(chao)m6A水平和m6A相關蛋白的影(ying)響 3、YTHDF2招募相關蛋白調控新生兒卵巢(chao)基因表達 采(cai)用(yong)IP-MS分析研究暴露于20.0 mg/kg FEN的(de)1dpp卵巢中(zhong)與(yu)YTHDF2相關(guan)的(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質。在(zai)對照組和20.0 mg/kg FEN組中(zhong)，共(gong)(gong)鑒定出1223個和985個推測的(de)YTHDF2互作(zuo)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)，兩組中(zhong)共(gong)(gong)有840個相互作(zuo)用(yong)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)，主要(yao)富集在(zai)mRNA加工、細胞(bao)質顆粒和mRNA結合相關(guan)的(de)途徑中(zhong)。其中(zhong)，檢測到多(duo)個m6A甲基化閱讀蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)，如“IGF2BP1-3, HNRNPA2B1”，包括核(he)心蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)“DDX6”和最(zui)近發現的(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)“HNRNPU, DHX9, MYO6, MYO1C”在(zai)內的(de)多(duo)個參與(yu)P小體（P-body）組裝的(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)，以及“G3BP1”等應激顆粒（SGs）組裝蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)。 此(ci)外(wai)，RNA-seq顯(xian)示，暴(bao)露(lu)于(yu)(yu)20.0 mg/kg FEN的(de)(de)(de)1dpp卵巢(chao)中(zhong)(zhong)有128個(ge)DEGs，其中(zhong)(zhong)91個(ge)上(shang)調，37個(ge)下調。GO分析(xi)顯(xian)示，DEGs在免疫反(fan)應、刺激反(fan)應和應激反(fan)應中(zhong)(zhong)富(fu)集。DEGs是否(fou)可(ke)能是YTHDF2的(de)(de)(de)直接靶(ba)點(dian)？GACU/A是YTHDF2的(de)(de)(de)主(zhu)要結合基(ji)(ji)序(xu)(xu)。因此(ci)，對GACU/A序(xu)(xu)列在DEGs起始和終止密(mi)碼子周圍±400 bp范(fan)圍內(nei)的(de)(de)(de)富(fu)集程度進行(xing)分析(xi)。分析(xi)顯(xian)示，在暴(bao)露(lu)于(yu)(yu)FEN的(de)(de)(de)卵巢(chao)中(zhong)(zhong)，上(shang)調和下調基(ji)(ji)因之間的(de)(de)(de)GACU/A基(ji)(ji)序(xu)(xu)富(fu)集改(gai)變，表明YTHDF2可(ke)能調節DEGs（圖3）。 圖(tu)3 FEN暴露對YTHDF2相互作(zuo)用蛋白及基(ji)因(yin)表達的影響 4、FEN暴露促進新生(sheng)兒卵(luan)巢中YTHDF2介導的(de)P小體組裝 通過(guo)公認(ren)的(de)(de)p小體標記物DDX6檢測(ce)發(fa)育的(de)(de)卵(luan)巢(chao)中p小體的(de)(de)組(zu)裝(zhuang)。與(yu)YTHDF2類似(si)，DDX6在(zai)(zai)16.5 dpc至5 dpp的(de)(de)原始卵(luan)泡(pao)發(fa)育期間的(de)(de)卵(luan)巢(chao)中表(biao)(biao)達，在(zai)(zai)囊腫和原始卵(luan)泡(pao)的(de)(de)卵(luan)母(mu)細胞內可見明顯明亮的(de)(de)胞質集合體。與(yu)對照組(zu)相比，2.0和20.0 mg/kg FEN組(zu)在(zai)(zai)1 dpp卵(luan)巢(chao)中DDX6的(de)(de)表(biao)(biao)達進一步(bu)顯著增(zeng)加，表(biao)(biao)明促進了(le)p小體的(de)(de)形成。此外(wai)，mIF和Co-IP證實了(le)FEN暴露誘導的(de)(de)YTHDF2與(yu)DDX6的(de)(de)相關性(xing)增(zeng)加。透(tou)射電鏡顯示，20.0 mg/kg的(de)(de)FEN組(zu)有大量活躍的(de)(de)高爾基體，特點是體積增(zeng)大，池堆積，并有多種分泌顆粒(li)存在(zai)(zai)。這些發(fa)現表(biao)(biao)明FEN暴露促進YTHDF2介導的(de)(de) P小體組(zu)裝(zhuang)，隨后影響新生(sheng)兒(er)卵(luan)母(mu)細胞中的(de)(de)RNA代謝和翻譯（圖4）。 圖4 FEN暴露促進(jin)YTHDF2和DDX6相互作用調(diao)節新(xin)生兒卵巢P小體組裝 5、YTHDF2介導FEN暴(bao)露(lu)的卵巢中異常原(yuan)始卵泡發(fa)生 為了進一步探討FEN對(dui)卵(luan)巢(chao)發育的(de)(de)(de)影(ying)響，收(shou)集(ji)16.5 dpc卵(luan)巢(chao)，分別用0、2、20μM FEN培(pei)養(yang)4天（相(xiang)(xiang)當于(yu)1 dpp）。在卵(luan)巢(chao)培(pei)養(yang)中(zhong)，FEN組的(de)(de)(de)原(yuan)始(shi)卵(luan)泡(pao)百(bai)分比明(ming)(ming)顯(xian)下降(jiang)(jiang)，囊腫卵(luan)母細(xi)胞的(de)(de)(de)發生率(lv)明(ming)(ming)顯(xian)增加(jia)，表明(ming)(ming)FEN直(zhi)接抑制(zhi)了原(yuan)始(shi)卵(luan)泡(pao)的(de)(de)(de)形成(cheng)。mIF實驗證實，與(yu)對(dui)照組（DMSO）相(xiang)(xiang)比，在2或20μM FEN的(de)(de)(de)處(chu)理下，YTHDF2和DDX6的(de)(de)(de)共定(ding)位增加(jia)。這些(xie)結(jie)(jie)果與(yu)妊娠暴露的(de)(de)(de)新生小鼠中(zhong)發現的(de)(de)(de)FEN的(de)(de)(de)影(ying)響一致。此外，將攜帶靶向YTHDF2 shRNA的(de)(de)(de)慢(man)病(bing)(bing)毒引(yin)入(ru)16.5 dpc子房培(pei)養(yang)中(zhong)，YTHDF2表達降(jiang)(jiang)低導致YTHDF2與(yu)DDX6共定(ding)位的(de)(de)(de)顯(xian)著(zhu)減少，同時DDX6的(de)(de)(de)病(bing)(bing)灶減少。這些(xie)結(jie)(jie)果表明(ming)(ming)，YTHDF2促進了胎兒卵(luan)巢(chao)中(zhong)暴露于(yu)FEN的(de)(de)(de)p小體組裝。隨后，對(dui)原(yuan)始(shi)卵(luan)泡(pao)形成(cheng)的(de)(de)(de)分析表明(ming)(ming)，敲低YTHDF2可有效逆轉FEN對(dui)原(yuan)始(shi)卵(luan)泡(pao)形成(cheng)的(de)(de)(de)抑制(zhi)作用。與(yu)20μM FEN+sh-NC組相(xiang)(xiang)比，20μM FEN+sh-YTHDF2組原(yuan)始(shi)卵(luan)泡(pao)內卵(luan)母細(xi)胞比例(li)顯(xian)著(zhu)升高，囊腫卵(luan)母細(xi)胞比例(li)顯(xian)著(zhu)降(jiang)(jiang)低。上述結(jie)(jie)果表明(ming)(ming)，FEN通過YTHDF2介導的(de)(de)(de)p小體組裝破(po)壞原(yuan)始(shi)卵(luan)泡(pao)發生（圖5）。 圖5 敲低YTHDF2可逆轉(zhuan)FEN對卵巢培養(yang)中原(yuan)始卵泡發生(sheng)的影(ying)響(xiang) 6、妊娠后期(qi)暴露于FEN會(hui)影響雌(ci)性后代的卵巢功能(neng) 為(wei)了研究妊(ren)娠(shen)后期(qi)(qi)暴(bao)露于(yu)(yu)FEN對(dui)成年后代卵(luan)巢功能的(de)影響(xiang)，雌(ci)(ci)性(xing)幼(you)崽（F1代）在FEN組和(he)對(dui)照(zhao)組均(jun)被培養到8周齡。與(yu)對(dui)照(zhao)組相比(bi)，妊(ren)娠(shen)后期(qi)(qi)暴(bao)露于(yu)(yu)FEN導致(zhi)F1雌(ci)(ci)性(xing)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)體(ti)重顯(xian)著(zhu)(zhu)增加。在8周大時，這些(xie)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)與(yu)有生育能力的(de)雄(xiong)性(xing)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)配對(dui)。雖(sui)然各組間(jian)第一(yi)窩幼(you)鼠(shu)(shu)數量無顯(xian)著(zhu)(zhu)差異(yi)，但F2小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)的(de)出(chu)生體(ti)重較對(dui)照(zhao)組有顯(xian)著(zhu)(zhu)增加。8周齡F1小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)卵(luan)巢形態(tai)學分析顯(xian)示(shi)(shi)，20.0 mg/kg FEN組卵(luan)巢最(zui)大截(jie)面(mian)積顯(xian)著(zhu)(zhu)小(xiao)(xiao)(xiao)于(yu)(yu)對(dui)照(zhao)組，卵(luan)巢系數（卵(luan)巢濕(shi)重與(yu)體(ti)重之(zhi)比(bi)）也顯(xian)著(zhu)(zhu)降低。采用ELISA法測(ce)定(ding)8周齡F1雌(ci)(ci)性(xing)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)血清激(ji)(ji)素水平。結(jie)果顯(xian)示(shi)(shi)，與(yu)對(dui)照(zhao)組相比(bi)，FEN暴(bao)露組的(de)促性(xing)腺(xian)激(ji)(ji)素（FSH）和(he)促黃(huang)體(ti)生成素（LH）水平顯(xian)著(zhu)(zhu)升高，同時孕酮（P4）和(he)抗繆勒管激(ji)(ji)素（AMH）水平顯(xian)著(zhu)(zhu)降低。雌(ci)(ci)激(ji)(ji)素（E2）水平保(bao)持不變。這些(xie)觀察結(jie)果與(yu)POI的(de)特征非常相似（圖(tu)6）。 研究結果(guo)表明(ming)，妊娠后(hou)期(qi)(qi)暴露于(yu)FEN會對成年后(hou)雌性后(hou)代的(de)卵巢(chao)功能產生持久影響，這(zhe)可(ke)能源于(yu)其早期(qi)(qi)生活中原始卵泡發生的(de)受損。 圖6 妊娠晚期(qi)暴(bao)露于(yu)FEN對子代卵巢功能的影響
04、研(yan)究結論 該研究首次證(zheng)明，妊娠后(hou)期(qi)暴(bao)露于(yu)FEN破壞了(le)原始卵泡發(fa)(fa)育(yu)，并(bing)可能(neng)導(dao)(dao)致后(hou)代成年后(hou)發(fa)(fa)生(sheng)POI的可能(neng)性。我們發(fa)(fa)現FEN誘(you)導(dao)(dao)了(le)m6A修飾的改(gai)變，并(bing)觸(chu)發(fa)(fa)了(le)YTHDF2對p小體的組裝。該研究與(yu)健康與(yu)疾病的發(fa)(fa)育(yu)起(qi)源理論（DOHaD）一(yi)致，即在生(sheng)命早期(qi)接觸(chu)EDCs會影響女(nv)性的發(fa)(fa)育(yu)，并(bing)有助于(yu)其長(chang)期(qi)的生(sheng)殖(zhi)健康結果。
原文鏈接 //doi.org/10.1016/j.scitotenv.2024.171790
