2024-07-19
近(jin)日，武漢大學(xue)中南(nan)醫院在(zai)生物學(xue)領域的(de)(de)《communications biology》發(fa)表新研究(jiu)(jiu)成果！本(ben)研究(jiu)(jiu)在(zai)4個ST1049-KL5肺炎(yan)克雷(lei)伯(bo)菌(jun)分離株中鑒定了一個結(jie)合的(de)(de)IncM1質粒pKPC_NDM，它共同攜帶(dai)blaKPC-2和blaNDM-1基因(yin)。該質粒表現(xian)出較高的(de)(de)種內和種間(jian)可轉移(yi)性，并(bing)增(zeng)強了碳(tan)青霉烯類(lei)耐藥性。本(ben)研究(jiu)(jiu)總結(jie)了KPC_NDM_CRKP爆發(fa)的(de)(de)特(te)點(dian)，并(bing)強調了持續監測和感染控(kong)制(zhi)策略的(de)(de)重要(yao)性，以應對ST1049肺炎(yan)克雷(lei)伯(bo)菌(jun)菌(jun)株帶(dai)來的(de)(de)挑戰。 本研究(jiu)的細菌基因組完(wan)成圖測序(xu)和分析由(you)上海(hai)派森諾(nuo)生物科技股份有限公司完(wan)成。 01、研究背景 肺炎克雷伯菌(jun)是(shi)一(yi)種(zhong)重要(yao)(yao)的(de)(de)機(ji)會性(xing)病(bing)原(yuan)體，可引起社區(qu)獲得性(xing)感染和醫院感染。該(gai)菌(jun)引起的(de)(de)感染，特(te)別是(shi)與(yu)碳青(qing)(qing)(qing)霉(mei)烯(xi)類(lei)(lei)耐藥性(xing)和高毒力相(xiang)關的(de)(de)感染，可導致高發(fa)病(bing)率和死亡率。碳青(qing)(qing)(qing)霉(mei)烯(xi)耐藥的(de)(de)多種(zhong)機(ji)制涉及碳青(qing)(qing)(qing)霉(mei)烯(xi)酶(mei)(mei)的(de)(de)產生，其中(zhong)碳青(qing)(qing)(qing)霉(mei)烯(xi)酶(mei)(mei)(KPC)和β-內酰胺(an)酶(mei)(mei)(NDM)是(shi)最常見的(de)(de)兩(liang)種(zhong)類(lei)(lei)型。以前(qian)的(de)(de)研究(jiu)(jiu)主要(yao)(yao)集中(zhong)在(zai)(zai)闡明KPC和NDM共(gong)同(tong)(tong)產生碳青(qing)(qing)(qing)霉(mei)烯(xi)抗性(xing)的(de)(de)出(chu)現，缺乏對其暴(bao)發(fa)的(de)(de)流行病(bing)學特(te)征的(de)(de)全面探(tan)索。此外，blaKPC-2和blaNDM-1基(ji)因的(de)(de)存在(zai)(zai)通常與(yu)分離的(de)(de)質粒(li)有關，但這兩(liang)個碳青(qing)(qing)(qing)霉(mei)烯(xi)酶(mei)(mei)基(ji)因在(zai)(zai)同(tong)(tong)一(yi)質粒(li)內共(gong)存以及它(ta)們(men)潛在(zai)(zai)的(de)(de)協同(tong)(tong)作用的(de)(de)研究(jiu)(jiu)較少。 02、研(yan)究材料與方法(fa) 1.實驗(yan)材料：產KPC和(he)NDM碳青霉烯酶的(de)肺炎克雷伯菌 2.測序平臺：illumina+Pacbio 3.分析(xi)內容：細菌基因組完成圖測(ce)序、比較基因組圈圖、easyfig遺傳環(huan)境分析(xi)、cgMLST分析(xi)、質(zhi)粒復制子分析(xi)、系統進化樹構建等(deng) 03、研究結果 肺(fei)炎克(ke)雷(lei)伯菌(jun)感染患者的(de)臨床特(te)點 本研究中(zhong)所有患(huan)者均(jun)表(biao)(biao)現出(chu)嚴重的(de)基礎疾病，并(bing)伴肺炎克雷伯菌感(gan)染(ran)。抗(kang)菌治(zhi)療包括β-內酰胺/β-內酰胺酶抑(yi)制劑(ji)組合、碳青(qing)霉烯類以及多粘菌素B和替加環素。感(gan)染(ran)ST1049 KPC_NDM_CRKP的(de)患(huan)者表(biao)(biao)現出(chu)較差(cha)的(de)治(zhi)療效果，4名患(huan)者中(zhong)有2名死于多器官(guan)感(gan)染(ran)和敗血癥。相反，ST11 KPC_NDM_CRKP感(gan)染(ran)的(de)患(huan)者表(biao)(biao)現出(chu)更有利的(de)恢復。 肺炎克(ke)雷伯菌分離株的克(ke)隆性和(he)遺傳親緣(yuan)性 脈沖凝膠電泳顯示，除(chu)KP4007外(wai)所有ST1049肺炎克雷(lei)默(mo)菌(jun)分離(li)株(zhu)克隆親緣性(xing)高。分離(li)株(zhu)KP1527、KP2094和KP1078表(biao)現出相(xiang)(xiang)同的(de)電泳譜帶，與(yu)初始(shi)分離(li)株(zhu)KP3594僅相(xiang)(xiang)差兩條譜帶。cgSNP進化(hua)樹(shu)進一步證實了(le)這些(xie)發現，揭示了(le)ST1049 KPC_NDM_CRKP菌(jun)株(zhu)之間密切(qie)的(de)遺傳關系。相(xiang)(xiang)比之下，雖然ST11 KPC_NDM_CRKP組在系統發育譜上(shang)具有遺傳同源性(xing)，但(dan)其在PFGE模式(shi)上(shang)表(biao)現出克隆異質性(xing)。 圖(tu)1 臨床肺(fei)炎克(ke)雷(lei)伯菌克(ke)隆及遺傳親緣關(guan)系分析 ST1049 KPC_NDM_CRKP質粒的比(bi)較基因(yin)組分析 WGS測序揭示了KPC_NDM_CRKP菌株中(zhong)對抗生(sheng)素(su)耐藥(yao)性和毒力基(ji)因譜上具(ju)有(you)高遺傳多(duo)(duo)樣性。具(ju)體來說，blaKPC-2被(bei)發現(xian)存(cun)在(zai)于一個(ge)(ge)(ge)IncFII/IncR型(xing)(xing)多(duo)(duo)次耐藥(yao)質(zhi)(zhi)粒(li)上，而(er)blaNDM-1在(zai)ST11 KPC_NDM_CRKP分離株的(de)(de)IncN/IncC質(zhi)(zhi)粒(li)中(zhong)被(bei)鑒定(ding)出(chu)來。所有(you)ST1049 KPC_NDM_CRKP分離株都含(han)有(you)76,517 bp的(de)(de)IncM1質(zhi)(zhi)粒(li)，該質(zhi)(zhi)粒(li)同時攜(xie)帶(dai)blaKPC-2、blaNDM-1和qnrS1基(ji)因；還(huan)攜(xie)帶(dai)一個(ge)(ge)(ge)含(han)有(you)多(duo)(duo)種抗生(sheng)素(su)耐藥(yao)基(ji)因及廣(guang)譜β-內(nei)酰胺酶基(ji)因的(de)(de)IncFII(K)型(xing)(xing)耐藥(yao)質(zhi)(zhi)粒(li)，以及一個(ge)(ge)(ge)編碼毒力因子的(de)(de)IncFIB型(xing)(xing)質(zhi)(zhi)粒(li)。質(zhi)(zhi)粒(li)pKPC_NDM與(yu)本院之前(qian)存(cun)檔的(de)(de)質(zhi)(zhi)粒(li)CRKP_35_unnamed4完(wan)全一致，還(huan)與(yu)從浙(zhe)江省的(de)(de)大腸桿菌EC14株中(zhong)獲得(de)的(de)(de)攜(xie)帶(dai)blaNDM-1的(de)(de)IncM2型(xing)(xing)質(zhi)(zhi)粒(li)pEC14-NDM-1高度(du)相似(si)。其他IncM1型(xing)(xing)質(zhi)(zhi)粒(li)則攜(xie)帶(dai)了blaKPC-2或blaCTX-M-3基(ji)因。pKPC_NDM中(zhong)攜(xie)帶(dai)blaKPC-2的(de)(de)區域(yu)類(lei)似(si)于在(zai)pKpc-LKEC中(zhong)報道的(de)(de)NTEKPC-Id結構，而(er)blaNDM-1區域(yu)與(yu)IncN型(xing)(xing)質(zhi)(zhi)粒(li)pNDM1-CBG中(zhong)的(de)(de)有(you)較高相似(si)性。 圖2 質粒比較分析(xi) 轉(zhuan)導(dao)子/轉(zhuan)化子的表征描(miao)述(shu)和pKPC_NDM可轉(zhuan)移性的驗證 從供(gong)體(ti)ST1049型(xing)(xing)KPC_NDM_CRKP菌(jun)株(zhu)向受體(ti)大腸(chang)桿菌(jun)EC600成功轉移(yi)pKPC_NDM，其(qi)(qi)轉移(yi)頻率相較(jiao)于(yu)ST11型(xing)(xing)KPC_NDM_CRKP中(zhong)攜帶(dai)blaKPC-2或blaNDM-1的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)更(geng)高(gao)。pKPC_NDM還能從ST1049型(xing)(xing)KPC_NDM_CRKP進(jin)一步轉移(yi)到碳青霉烯敏感的(de)肺(fei)炎克雷伯菌(jun)，并且能從供(gong)體(ti)大腸(chang)桿菌(jun)EC600::pKPC_NDM轉移(yi)至ST1049型(xing)(xing)CSKP受體(ti)中(zhong)。本(ben)研(yan)究驗證了野生(sheng)菌(jun)株(zhu)及攜帶(dai)pKPC_NDM的(de)轉導子(zi)/轉化子(zi)中(zhong)共表(biao)(biao)達(da)KPC和(he)NDM碳青霉烯酶(mei)。值得注意的(de)是，在阿曲庫銨與頭孢他啶/阿維巴坦(tan)雙碟測試中(zhong)觀察到的(de)“鬼影區(qu)”現(xian)象，表(biao)(biao)明了對攜帶(dai)pKPC_NDM菌(jun)株(zhu)的(de)協(xie)同抑制作(zuo)用(yong)。對pKPC_NDM進(jin)行(xing)oriT分析，發(fa)(fa)現(xian)其(qi)(qi)與寬宿主范(fan)圍的(de)接(jie)合性IncM2型(xing)(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)pCTXM-360中(zhong)的(de)oriT_pCTXM360的(de)相似(si)度最(zui)高(gao)。與含有oriTKN位(wei)點的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)進(jin)行(xing)比較(jiao)，發(fa)(fa)現(xian)oriTKN與IncM1型(xing)(xing)接(jie)合質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)之間存(cun)在強烈的(de)相關(guan)性，強調了其(qi)(qi)在IncM1質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)傳播中(zhong)的(de)關(guan)鍵作(zuo)用(yong)。此外，oriTKN序列的(de)插入促進(jin)了E. coli S17中(zhong)pUCP24自發(fa)(fa)向E. coli EC600和(he)肺(fei)炎克雷伯菌(jun)ATCC 700603的(de)接(jie)合轉移(yi)。 圖3 使用APB/EDTA增強方法進(jin)行碳青(qing)霉烯酶表(biao)型確認 pKPC_NDM受者(zhe)的(de)穩(wen)定(ding)性(xing)、不(bu)相容性(xing)和碳青霉烯耐藥維(wei)持 當(dang)通(tong)過(guo)接合引入(ru)ST1049型CSKP受體和大腸桿(gan)菌(jun)(jun)EC600時，pKPC_NDM表現(xian)出強大的(de)(de)穩定(ding)性(xing)(xing)(xing)。然而(er)，碳(tan)青(qing)霉(mei)烯(xi)(xi)耐藥(yao)性(xing)(xing)(xing)維持結果(guo)顯示，在(zai)傳(chuan)代過(guo)程中，3.9%的(de)(de)大腸桿(gan)菌(jun)(jun)受體和2.3%的(de)(de)肺炎克雷伯菌(jun)(jun)受體喪失了(le)碳(tan)青(qing)霉(mei)烯(xi)(xi)耐藥(yao)性(xing)(xing)(xing)，所有這些菌(jun)(jun)株均丟(diu)失了(le)整個(ge)pKPC_NDM質(zhi)(zhi)粒(li)(li)。有趣的(de)(de)是，一個(ge)特(te)定(ding)的(de)(de)轉(zhuan)導(dao)子降低(di)了(le)碳(tan)青(qing)霉(mei)烯(xi)(xi)耐藥(yao)性(xing)(xing)(xing)但失去了(le)對CAZ/AVI的(de)(de)耐藥(yao)性(xing)(xing)(xing)，測序結果(guo)確定(ding)了(le)blaNDM-1基因區域的(de)(de)丟(diu)失。進一步實驗中，利用CRISPR-Cas9方法(fa)成(cheng)功(gong)敲除(chu)了(le)blaKPC-2基因，但嘗試敲除(chu)blaNDM-1基因導(dao)致宿主菌(jun)(jun)株丟(diu)失了(le)整個(ge)pKPC_NDM質(zhi)(zhi)粒(li)(li)。不相容性(xing)(xing)(xing)試驗發現(xian)pKPC_NDM與(yu)KPC或(huo)NDM產(chan)生(sheng)的(de)(de)CRKP菌(jun)(jun)株中原有的(de)(de)IncFII/IncR型blaKPC-2質(zhi)(zhi)粒(li)(li)和IncN或(huo)IncC型blaNDM-1質(zhi)(zhi)粒(li)(li)相容，所有轉(zhuan)化菌(jun)(jun)落即便在(zai)無(wu)抗生(sheng)素培養(yang)板上培養(yang)后仍保留了(le)pKPC_NDM以(yi)及攜帶blaKPC-2或(huo)blaNDM-1的(de)(de)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)。 藥敏試驗結果 KPC_NDM_CRKP菌株對(dui)所有臨床使用的β-內酰胺類(lei)(lei)藥(yao)(yao)物(wu)均(jun)表現出耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)性(xing)，然而他們仍然對(dui)多粘菌素(su)(su)B和替加(jia)環素(su)(su)等最后手段的抗生(sheng)素(su)(su)敏感，并(bing)對(dui)氨基糖苷類(lei)(lei)、喹(kui)諾酮(tong)類(lei)(lei)和甲氧(yang)芐胺甲惡唑(zuo)表現出不同的耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)模式。盡管CAZ/AVI的效力有限，但AVI與ATM或美西林(lin)南聯合治療(liao)對(dui)KPC_NDM_CRKP菌株有顯著(zhu)改(gai)善。此外(wai)，當blaKPC或blaNDM攜帶(dai)區(qu)域(yu)被刪(shan)除(chu)時，觀察到碳青(qing)霉烯類(lei)(lei)MIC降低了兩倍。 致病(bing)性評估(gu)及時效測定結果 大多數KPC_NDM_CRKP分離株對(dui)人(ren)血清(qing)表(biao)現出高(gao)敏(min)感性，ST1049型(xing)肺炎克雷(lei)伯(bo)菌的整(zheng)體生物膜產生量(liang)顯著高(gao)于ST11型(xing)肺炎克雷(lei)伯(bo)菌。時間(jian)殺滅實驗顯示(shi)，就體外針對(dui)KPC_NDM_CRKP菌株而言，頭孢他(ta)啶/阿維巴坦(tan)、阿曲(qu)庫銨(an)或美羅培南單(dan)藥治(zhi)療效果有限(xian)，而聯合療法則展(zhan)現出協同(tong)效應。 圖4 臨(lin)床肺炎克雷伯(bo)菌致病(bing)性特征及時(shi)間殺傷曲線 ST1049肺炎克雷伯菌和KPC_NDM_CRKP核心基因組多(duo)位點序列分型分析 使(shi)用(yong)138個(ge)肺炎克(ke)雷伯菌(jun)基因組(zu)進行(xing)cgMLST分(fen)析，包括23個(ge)ST1049菌(jun)株(zhu)和(he)115個(ge)其(qi)他序列類型的(de)(de)KPC_NDM_CRKP菌(jun)株(zhu)。結(jie)果發現ST1049主要在(zai)中國區域流(liu)行(xing)，且(qie)在(zai)KPC_NDM_CRKP菌(jun)株(zhu)間(jian)存在(zai)顯著多(duo)樣性。KPC_NDM_CRKP的(de)(de)流(liu)行(xing)涉(she)及幾個(ge)成功的(de)(de)克(ke)隆(long)，這表明了(le)(le)基因組(zu)和(he)地(di)理上(shang)的(de)(de)異質性。有趣的(de)(de)是(shi)，ST1049 KPC_NDM_CRKP的(de)(de)爆(bao)發最初僅在(zai)本院(yuan)觀(guan)察到，這提示了(le)(le)一種可能(neng)的(de)(de)醫院(yuan)內傳(chuan)播鏈。此發現強調了(le)(le)對這一特殊克(ke)隆(long)進行(xing)持(chi)續監控(kong)(kong)和(he)感染控(kong)(kong)制的(de)(de)重要性，以防止其(qi)進一步擴散。 圖5 核心基(ji)因組多位點序列(lie)分(fen)(fen)型(cgMLST)分(fen)(fen)析 04、 結(jie) 論 攜帶同時擁有blaKPC-2和blaNDM-1基因的IncM1型質粒(li)pKPC_NDM的ST1049-KL5型CRKP的出現及(ji)克隆傳播對公共衛生構成了(le)(le)嚴峻挑戰。本研究凸顯了(le)(le)ST1049型菌株(zhu)作為高毒性及(ji)多(duo)重耐(nai)藥質粒(li)攜帶者(zhe)的潛力(li)，強調了(le)(le)持續監測(ce)和實施有效感染控(kong)制策略的重要性。這些發現不僅增(zeng)進對復雜耐(nai)藥機(ji)制和病原(yuan)體傳播動(dong)態的理解，而且為未(wei)來針對性的治療干(gan)預和防(fang)控(kong)措施提供了(le)(le)科學依據。 如需進(jin)一步討論，歡迎發(fa)郵(you)件(jian)或(huo)者致電(dian)我(wo)們喲（郵(you)箱地址(zhi)：microsupport@doudin.cn，聯系電(dian)話：021-80118168-8617）！
文(wen)章(zhang)索引： Liu, Hongmao, et al. "Prevalence of ST1049-KL5 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with a bla KPC-2 and bla NDM-1 co-carrying hypertransmissible IncM1 plasmid." Communications Biology 7.1 (2024): 695.
