2024-08-12
文章題目：LSD1 promotes the FSH responsive follicle formation by regulating autophagy and repressing Wt1 in the granulosa cells 中國農業大學在《Science Bulletin》上發表了LSD1通過調節顆粒細胞中的自噬和抑制Wt1來促進FSH反應性卵泡形成的研究成果，影響因子18.9。本研究中轉(zhuan)錄組檢測及部分數據(ju)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。 1、研究背景 在(zai)生長中(zhong)的(de)卵泡中(zhong)，卵母(mu)細胞的(de)存活和(he)成熟很大程度上(shang)依賴于(yu)體(ti)細胞的(de)支(zhi)持，以促進FSH誘導的(de)相互信號傳(chuan)導和(he)化學通(tong)訊。盡管體(ti)細胞中(zhong)的(de)細胞凋(diao)亡(wang)和(he)自噬參與FSH誘導的(de)卵泡發育(yu)過(guo)程，但其潛在(zai)機制需要大量研究。 表觀遺傳(chuan)修(xiu)飾，如(ru)DNA甲基(ji)化(hua)、翻譯(yi)后組(zu)蛋白修(xiu)飾和非編碼RNA調控，可以獨(du)立(li)或協同影響細胞命運。作者之前(qian)的(de)研究(jiu)表明，在胎兒卵(luan)(luan)巢卵(luan)(luan)母細胞中，LSD1調節自噬接(jie)頭p62的(de)轉(zhuan)錄，并在小鼠原始(shi)卵(luan)(luan)泡(pao)形成過程中通(tong)過其(qi)H3K4me2去甲基(ji)化(hua)酶活性影響自噬。然而，目前(qian)尚不清楚GC中的(de)LSD1是否在成人卵(luan)(luan)泡(pao)生長的(de)發育中起關鍵作用。 2、技術路線 3、研究內容 在FSH反應階段(duan)，LSD1在GC中的表達增加 為了研究LSD1在小鼠卵泡(pao)(pao)(pao)發育(yu)過程中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)生(sheng)理(li)(li)作(zuo)用(yong)，作(zuo)者先明(ming)確了LSD1在FSH誘(you)導的(de)(de)卵泡(pao)(pao)(pao)生(sheng)長(chang)過程中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)。為了確定(ding) LSD1 水平是否與(yu)促性腺激(ji)素誘(you)導的(de)(de)激(ji)活相關(guan)，施用(yong)了功能類似于 FSH 的(de)(de) PMSG 來刺激(ji)卵泡(pao)(pao)(pao)生(sheng)長(chang)。如圖1a所示，當(dang)小鼠注射PMSG時，PMSG處(chu)理(li)(li)后24 h至(zhi)36 h卵巢(chao)(chao)中(zhong)(zhong)(zhong)LSD1的(de)(de)蛋白質和mRNA水平均顯著(zhu)增(zeng)加，然后在48 h后略有下(xia)降(jiang)。接下(xia)來，在PMSG注射后的(de)(de)不同時間點分離卵巢(chao)(chao)GC，通過WB分析研究卵泡(pao)(pao)(pao)發育(yu)過程中(zhong)(zhong)(zhong)GC中(zhong)(zhong)(zhong)LSD1的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)。此外，還對卵巢(chao)(chao)切片進行了IHC 染色。簡而(er)言之，隨著(zhu)卵泡(pao)(pao)(pao)的(de)(de)發育(yu)，PMSG處(chu)理(li)(li)后從12小時到36小時GCs中(zhong)(zhong)(zhong)LSD1的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)水平逐漸(jian)增(zeng)加（圖1b-c）。這些(xie)結果表(biao)(biao)明(ming)LSD1可能在竇卵泡(pao)(pao)(pao)(Afs)的(de)(de)形(xing)成中(zhong)(zhong)(zhong)發揮重要(yao)作(zuo)用(yong)。 圖1 GCs中LSD1表(biao)達的增加與小鼠卵泡發育階段有關 Lsd1的GC特異性敲除導致雌性小鼠生育能力低下 為了研究LSD1在生長卵泡GC中的功能，通過雜交產生了具有GC特異性缺失Lsd1的小鼠模型Lsd1f/f；Foxl2-Cre。首先，在用PMSG和hCG誘導17小時后，評估Lsd1缺失對排卵的影響。與對照小鼠相比，Lsd1敲除小鼠排出成熟卵母細胞數量顯著減少（圖2a-b）。接著，作者研究了Lsd1被特異性刪除后雌性的生殖能力。評估Lsd1-null小鼠的生育能力，發現Lsd1f/f；Foxl2-Cre雌性在交配后七個月時未能產生后代（圖2c），這表明其生殖壽命顯著縮短并獲得不育表型。 LSD1參與促性腺激素依賴性卵泡發育 鑒于Lsd1敲除小鼠的生育能力受損，作者又進一步研究了生長卵泡GC中Lsd1缺失對FSH的影響。注射PMSG后48 h，3周齡 Lsd1敲除小鼠的卵巢明顯小于對照小鼠（圖2d），且卵巢重量與體重的比值顯著降低（圖2e）。此外，WB（GCs樣本）和IF（卵巢樣本）證實了卵巢的敲除效率（圖2f-g）。根據組織學和統計分析，在GCs中Lsd1缺失后，包括初級卵泡（PFs）和AFs在內的生長卵泡的數量顯著減少（圖2h-i）。 圖2 GCs中特異性敲除Lsd1導致低生育能力 為了研究LSD1在卵巢中的精確功能并排除GC特異性Lsd1敲除對原始卵泡池的可能影響，其可能會影響生長卵泡的募集，通過雜交生成了一種具有GC特異性缺失Lsd1的新小鼠模型Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2，21-23天的小鼠接受PMSG注射以刺激卵泡生長。48小時后，與相應的對照小鼠相比，Lsd1敲除小鼠的卵巢大小和卵巢重量與體重之比明顯降低（圖3a-b）。此外，通過免疫印跡（GCs樣品）和IF（卵巢樣品）證實了敲除效率（圖3c-d）。組織學和統計分析結果表明，Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠在卵巢中觀察到的AF數量可以忽略不計（圖3e）。此外，在PMSG處理后48小時通過蛋白質質譜分析了GC中Lsd1條件敲除后蛋白質水平的變化。然后，KEGG富集分析表明，Lsd1的耗竭導致蛋白質表達發生顯著變化，與參與蛋白質合成、雌激素產生等的信號通路有關（圖3f）。 為了更準確地分析LSD1蛋白功能對卵泡發育的影響，作者對Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠注射PMSG 24 h后的樣品進行了分析。出乎意料的是，Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠和Lsd1f/f小鼠的卵巢大小和卵巢重量體重比都非常相似(圖3g-h)，在任何發育階段的卵泡數量均無顯著差異(圖3k)，并且證實了基因敲除的有效性(圖3i-j)。根據蛋白質組學分析，在此期間表現出表達變化的蛋白質參與了與細胞代謝、激素反應和細胞死亡相關的信號通路(圖3l)。總之，在小鼠GCs中敲除LSD1蛋白導致卵泡在高度依賴FSH的快速生長期發育不正常。 圖3 LSD1對于從胃前到心房顫動階段的過渡尤為重要 LSD1通過誘導GCs自噬促進AFs的形成 為了研究LSD1蛋白缺失后卵泡發育的模式，收集了3周齡Lsd1f/f小鼠和Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠的卵巢，這些小鼠經PMSG處理(48小時)，冷凍并切片。采用結晶紫染色檢測卵泡形態，選擇含有多層GC的大SFs的GC進行分析。LCM捕獲的卵泡GC用于轉錄組分析。通過KEGG分析和GSEA分析，與對照組小鼠相比，PMSG處理后48小時在Lsd1敲除小鼠中觀察到與細胞代謝、激素反應、自噬和細胞凋亡相關的基因表達發生顯著變化（圖4a-c）。PMSG處理Lsd1敲除小鼠24或48小時后，自噬相關蛋白的表達水平顯著降低(圖4d)，IF和透射電子顯微鏡（TEM）結果表明，與對照組相比，Lsd1耗盡后大SFs的GC中的自噬水平受到顯著抑制(圖4e-f)。 為了進一步研究Lsd1敲除對GCs自噬的影響，作者采用RFP-EGFP-LC3小鼠模型來研究Lsd1的缺失是否會影響自噬酶體的形成。結果表明，在PMSG處理48h后，LC3- Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2卵巢中GFP和RFP合并的熒光信號和單獨的RFP熒光信號都比對照卵巢弱。因此，自噬體在LC3- Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2卵巢中不能正常積累(圖4g-i)。綜上所述，這些結果再次證實了LSD1在生長卵泡GCs中的表達，通過誘導自噬來促進AFs的形成，以響應FSH。 圖4 LSD1參與體內自噬相關AFs的形成 自噬對AFs的形成起重要作用 首先(xian)，作者評估了(le)(le)(le)生理(li)條(tiao)(tiao)件下激素(su)誘導的(de)(de)(de)竇卵(luan)泡(pao)形成的(de)(de)(de)變化。當小(xiao)(xiao)鼠注(zhu)射PMSG時，卵(luan)巢和GC中LC3的(de)(de)(de)蛋白質和mRNA水平(ping)隨著(zhu)時間的(de)(de)(de)推(tui)移而顯(xian)著(zhu)增加。TEM顯(xian)示，與未(wei)處理(li)的(de)(de)(de)GC相比，PMSG處理(li)的(de)(de)(de)GC中存在更多的(de)(de)(de)自(zi)噬(shi)體(ti)或自(zi)噬(shi)酶(mei)體(ti)。此外，FSHRs在卵(luan)巢和GC中的(de)(de)(de)表(biao)達(da)響應PMSG啟動(dong)以時間依賴性方式上調，而GC中H3K4me2的(de)(de)(de)豐(feng)度(du)逐漸(jian)降低。為了(le)(le)(le)闡明GC中的(de)(de)(de)自(zi)噬(shi)蛋白是(shi)否參與卵(luan)泡(pao)的(de)(de)(de)周(zhou)期(qi)性募(mu)集(ji)，3周(zhou)齡小(xiao)(xiao)鼠腹膜內注(zhu)射PMSG和自(zi)噬(shi)抑(yi)制劑(ji)巴佛洛霉素(su)A1（Baf-A1）。結(jie)果(guo)表(biao)明，AF的(de)(de)(de)數量(liang)顯(xian)著(zhu)減少(shao)，這表(biao)明自(zi)噬(shi)參與了(le)(le)(le)AFs的(de)(de)(de)發(fa)(fa)展（圖S5e-f）。值得(de)注(zhu)意的(de)(de)(de)是(shi)，這些小(xiao)(xiao)鼠自(zi)噬(shi)抑(yi)制后AFs形成的(de)(de)(de)失敗與上述兩種Lsd1敲除小(xiao)(xiao)鼠模(mo)型(xing)中觀察到的(de)(de)(de)相似。因此，在生理(li)條(tiao)(tiao)件下，竇卵(luan)泡(pao)的(de)(de)(de)發(fa)(fa)育(yu)和周(zhou)期(qi)性募(mu)集(ji)需要(yao)增加GC中的(de)(de)(de)自(zi)噬(shi)。 為了證實LSD1通過自噬調節AFs的形成，作者利用自噬誘導劑雷帕霉素(Rap)來證實LSD1在誘導自噬中的作用。PMSG處理48小時后，Rap處理的Lsd1基因敲除小鼠卵巢略大于Lsd1f/f；Foxl2-CreERT2小鼠卵巢,小鼠的卵巢重量與體重之比有所增加(圖5a)。此外，通過免疫印跡(GCs樣本)和IF(卵巢樣本)證實了基因敲除效率和自噬(圖5b-c)。與先前基于Baf-A1處理的結論一致，誘導自噬基因表達可有效逆轉Lsd1特異性敲除引起的AFs數量的顯著減少(圖5d-e)。綜上所述，LSD1通過誘導自噬促進AFs的形成。 圖5 體內自噬的激活逆轉了Lsd1缺失時AFs形成的減少 為(wei)了進一步研究LSD1如何參與AFs形成相關基因表(biao)達的(de)(de)調(diao)(diao)節，作(zuo)者進行了CUT&Tag的(de)(de)測(ce)定。數據分析表(biao)明，LSD1和H3K4me2在整個GC的(de)(de)基因啟動子區域普(pu)遍存在（圖(tu)6a、b）。此外(wai)，GC顯示轉錄(lu)起始位點（TSS）周圍H3K4me2和LSD1的(de)(de)豐(feng)度全局增(zeng)加(jia)（圖(tu)6a-c）。此外(wai)，PMSG處理表(biao)達上(shang)調(diao)(diao)或下(xia)調(diao)(diao)的(de)(de)基因與LSD1和H3K4me2共調(diao)(diao)控的(de)(de)基因顯著重(zhong)(zhong)疊(die)（圖(tu)6d）。重(zhong)(zhong)疊(die)的(de)(de)基因包括參與新陳代(dai)謝、細胞生(sheng)長發育、細胞死亡和激(ji)素合成的(de)(de)基因（圖(tu)6d）。 圖6 LSD1主要通過調節H3K4甲基化水平控制包括Wt1在內的GC分化相關基因的轉錄 有趣的(de)(de)是，一(yi)些與(yu)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)調節相(xiang)關的(de)(de)基(ji)因也被富集。為(wei)了驗證(zheng)這些基(ji)因是否(fou)與(yu)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)相(xiang)關并(bing)與(yu)LSD1相(xiang)關，作(zuo)者(zhe)進行了ChIP-qPCR檢測。結(jie)果表明，LSD1和H3K4me2都(dou)直(zhi)接與(yu)Atg16l2啟(qi)動子中(zhong)的(de)(de)4761至5160 bp區域結(jie)合（圖(tu)6e-h）。先前的(de)(de)研究表明，ATG16L2可作(zuo)為(wei)競爭(zheng)性ATG16L1抑制(zhi)劑(ji)，從而(er)抑制(zhi)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)。此外，在(zai)作(zuo)者(zhe)的(de)(de)Lsd1敲除模型中(zhong)，ATG16L2的(de)(de)mRNA和蛋白質水平都(dou)有所增加(jia)（圖(tu)6i和7a）。這些結(jie)果表明，LSD1通(tong)過調節自(zi)(zi)噬(shi)(shi)抑制(zhi)基(ji)因Atg16l2的(de)(de)表達來調節GCs中(zhong)的(de)(de)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)。 LSD1和H3K4me2調節GC中Wt1的轉錄以支持FSH反應性 為了驗證LSD1和H3K4me2如何調節WT1反應性，進行了ChIP-qPCR分析。結果表明，LSD1和H3K4me2都直接結合到Wt1啟動子中2474 bp至2779 bp的區域（圖6j-m）。基于這些結果，假設LSD1和H3K4me2調節GC中Wt1的轉錄。作者進一步發現，在GCs中敲除Lsd1后，WT1的蛋白和mRNA水平均升高，這證實了上述測序結果和與WT1相關的IHC結果（圖7a-b）。進一步的證據表明，WT1在GC的細胞質和細胞核中表達。敲除Lsd1后，GC中WT1的蛋白水平升高（圖7d）。根據ChIP-qPCR分析，WT1直接與Fshr 啟動子中的971至1282 bp區域結合（圖6n-o）。這表明WT1調控Fshr的轉錄活性。與這一假設一致，證實WT1的過表達顯著降低了Fshr的轉錄活性，并且FSHR表達在Wt1敲低后上調（圖7a）。因此，WT1有助于Fshr表達的下調，而響應LSD1敲除的H3K4me2豐度增加可能促進Wt1的轉錄。與之前的研究一致，作者的結果表明自噬參與了WT1降解的過程。根據本研究的免疫印跡和IHC結果，自噬的誘導導致WT1的快速降解（圖 7c-d）。因此，假設自噬通過促進WT1降解來上調Fshr轉錄，以確保GC對FSH信號轉導的最佳反應。總之，LSD1缺陷導致的自噬抑制導致WT1降解失敗和AFs形成受損。 FSH影響LSD1在自噬中的調節作用 為了研究LSD1在GC中的功能及其與FSH誘導的關系，作者在KGN細胞中構建了Lsd1敲除細胞系（Lsd1-KO）。WB結果顯示，LSD1在Lsd1-KO細胞中被成功敲除（圖7e）。KGN細胞中LSD1的缺失導致自噬標志物LC3B II的蛋白質水平升高（圖7e）。這表明GC中Lsd1的敲除會增加細胞自噬。然而，FSH處理后，Lsd1-KO細胞中自噬標志物LC3B的蛋白水平下調，自噬相關ATG16L2蛋白水平升高（圖7e）。這表明FSH處理后Lsd1-KO細胞的自噬被阻斷。Lsd1-KO細胞系的這些結果與小鼠GCs表型一致。這些結果進一步表明，LSD1介導的GC自噬變化可能與FSH刺激有關。因此，GC中Lsd1的敲除導致異常自噬，進而影響GCs的發育，最終導致AFs形成失敗并最終導致發育異常。 圖7 LSD1和自噬共同下調GCs中WT1的水平，以支持FSH作用下進行性AFs的形成 4、研究結論 本研究為探究顆粒細胞中組蛋白去甲基化酶（LSD1）在有腔卵泡形成過程中的作用，構建了該編碼基因的多種顆粒細胞條件性敲除小鼠和細胞模型。證明組蛋白去甲基化酶（LSD1）是調節顆粒細胞自噬及顆粒細胞分化的重要分子開關。LSD1參與調控FSH介導的有腔卵泡發育及卵泡命運決定過程。一方面，敲除Lsd1會導致WT1的mRNA和蛋白水平積累，進而下調顆粒細胞中FSH受體（FSHR）的表達，進而抑制次級卵泡對FSH激素的響應。另一方面，敲除Lsd1會導致顆粒細胞中自噬相關蛋白Atg16l2的表達水平上調，從而抑制顆粒細胞自噬。該研究揭示了LSD1作為重要的表觀遺傳分子參與促性腺激素FSH調控雌性哺乳動物有腔卵泡形成的分子機制。
原(yuan)文索引： Zhu Z, He M, Zhang T, Zhao T, Qin S, Gao M, Wang W, Zheng W, Chen Z, Liu L, Hao M, Zhou B, Zhang H, Wang J, Wang F, Xia G, Wang C. LSD1 promotes the FSH responsive follicle formation by regulating autophagy and repressing Wt1 in the granulosa cells. Sci Bull (Beijing). 2024 Apr 30;69(8):1122-1136. doi: 10.1016/j.scib.2024.01.015. Epub 2024 Jan 17. PMID: 38302330.
