2024-09-01
文章題目：Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae capsular types, antibiotic resistance and virulence factors in China: a longitudinal, multi-centre study 技(ji)術手段：RNA-seq、全基因(yin)組測序、q-PCR、宏基因(yin)組 復旦大學(xue)附(fu)屬華山醫院(yuan)在國際著名雜志《Nature microbiology》發表了(le)關于中國耐(nai)碳(tan)青霉烯肺炎(yan)克(ke)雷伯菌莢(jia)膜類型(xing)、抗生素耐(nai)藥性(xing)和毒力因素縱向多中心研(yan)究的(de)相關文章，揭示了(le)CRKP血清型(xing)的(de)流行(xing)和動態且監測(ce)血清型(xing)變化對(dui)未來開發針對(dui)CRKP感染(ran)的(de)免疫策略的(de)重要性(xing)。本研(yan)究中轉錄組測(ce)序及部(bu)分分析均由上海(hai)派森(sen)諾生物(wu)科技(ji)股份有(you)限(xian)公司完成。
01、研究背景 耐碳青霉烯肺(fei)炎克(ke)雷(lei)伯菌(CRKP)由于其多重耐藥(yao)性(xing)質和感染高死亡率已成為(wei)(wei)對公眾健康的(de)(de)嚴重威脅(xie)。根據2023年(nian)(nian)中(zhong)國抗微(wei)生物(wu)藥(yao)物(wu)監測網(wang)絡(CHINET)的(de)(de)數據顯(xian)示(shi)，肺(fei)炎克(ke)雷(lei)伯菌已成為(wei)(wei)中(zhong)國臨(lin)床第二大(da)分(fen)離細菌，耐藥(yao)率從2005年(nian)(nian)的(de)(de)2.9%穩步上升至2023年(nian)(nian)的(de)(de)30.0% 。耐藥(yao)性(xing)的(de)(de)增加(jia)反過來限制(zhi)了(le)治療選擇，并(bing)增加(jia)了(le)對控制(zhi)CRKP感染的(de)(de)新策略的(de)(de)需求。
02、技(ji)術路(lu)線
03、研究(jiu)內(nei)容(rong) 1.CRKP分離株(zhu)莢(jia)膜及其(qi)抗菌(jun)特(te)性分析 2016-2020年(nian)，從(cong)中(zhong)(zhong)國(guo)26個省或直轄市(shi)的(de)(de)(de)40家醫(yi)院收(shou)治的(de)(de)(de)肺炎克雷伯(bo)菌感(gan)染(ran)的(de)(de)(de)成(cheng)年(nian)患者中(zhong)(zhong)共收(shou)集(ji)了1017株(zhu)(zhu)(zhu)非(fei)重復的(de)(de)(de)CRKP分(fen)(fen)離株(zhu)(zhu)(zhu)，這(zhe)些分(fen)(fen)離株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)大(da)多(duo)數都是blaKPC-2，同時鑒定出(chu)18株(zhu)(zhu)(zhu)非(fei)產碳青(qing)霉烯(xi)酶(mei)的(de)(de)(de)CRKP分(fen)(fen)離株(zhu)(zhu)(zhu)。莢膜基(ji)因分(fen)(fen)型發現58個不同的(de)(de)(de)K位(wei)點;K型以(yi)KL64型和KL47型居多(duo)。這(zhe)兩種K型的(de)(de)(de)出(chu)現頻率隨時間和地理的(de)(de)(de)變化(hua)而變化(hua)。KL64從(cong)2016年(nian)的(de)(de)(de)35.0%顯著增加到(dao)2020年(nian)的(de)(de)(de)59.6%，同時KL47從(cong)42.3%下降(jiang)到(dao)17.8%（圖(tu)(tu)1a）。KL64主(zhu)要(yao)分(fen)(fen)布(bu)(bu)在(zai)中(zhong)(zhong)國(guo)東(dong)部(bu)和中(zhong)(zhong)部(bu)，而KL47主(zhu)要(yao)分(fen)(fen)布(bu)(bu)在(zai)中(zhong)(zhong)國(guo)北部(bu)和東(dong)北部(bu)。通過(guo)測序(xu)展(zhan)示(shi)了不同K型菌株(zhu)(zhu)(zhu)在(zai)抗菌藥物(wu)敏(min)感(gan)性(xing)表(biao)型及碳青(qing)霉烯(xi)酶(mei)基(ji)因分(fen)(fen)布(bu)(bu)上(shang)的(de)(de)(de)差異(yi)。排名前七的(de)(de)(de)K型菌株(zhu)(zhu)(zhu)主(zhu)要(yao)與blaKPC-2基(ji)因相關，這(zhe)些菌株(zhu)(zhu)(zhu)對(dui)頭孢(bao)他啶(ding)-阿(a)維(wei)巴坦(tan)（CZA）敏(min)感(gan)，但對(dui)阿(a)米卡星(xing)耐藥（除(chu)KL19外）（圖(tu)(tu)1c）。 圖(tu)1 2016-2020年(nian)中國(guo)26個省市CRKP分(fen)離株(zhu)莢膜基因型及抗菌譜分(fen)析 2.CRKP分離株中與毒(du)力相關(guan)的基因(yin)攜帶情況 在(zai)所有CRKP分離(li)(li)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)通篩選了5個高(gao)(gao)毒(du)(du)(du)力相(xiang)(xiang)關(guan)基因(yin)，并(bing)將413株(zhu)(zhu)同(tong)時(shi)攜帶iucA和(he)rmpA/rmpA2基因(yin)的分離(li)(li)株(zhu)(zhu)分類為高(gao)(gao)毒(du)(du)(du)力CRKPs (hv-CRKPs)，其中(zhong)(zhong)(zhong)31株(zhu)(zhu)同(tong)時(shi)攜帶5個高(gao)(gao)毒(du)(du)(du)力相(xiang)(xiang)關(guan)基因(yin)。在(zai)前10個k型(xing)菌(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)，KL60含(han)hv-CRKP菌(jun)株(zhu)(zhu)的比例(li)最高(gao)(gao)（圖(tu)2a）,hv-CRKP的比例(li)從2016年的28.2%上升到2020年的45.7%，KL47的hv-CRKP水(shui)平增(zeng)加了三倍，相(xiang)(xiang)比之(zhi)下(xia)KL64中(zhong)(zhong)(zhong)hv-CRKP的頻率(lv)保持(chi)穩定（圖(tu)2b）,這種(zhong)變(bian)換趨(qu)勢主要(yao)與在(zai)KL64和(he)KL47菌(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)與毒(du)(du)(du)力相(xiang)(xiang)關(guan)的質(zhi)粒(li)有關(guan)（圖(tu)2c）。 圖2 CRKP菌株AMR及(ji)高(gao)毒力(li)相(xiang)關基因的分布 3.中國KL47和KL64型CRKP的基因組流行病學研究以及L1 - CRKP在中國的時空傳遞 為(wei)了(le)獲(huo)得兩種最常(chang)見的(de)(de)k型(xing)(xing)(xing)CRKP的(de)(de)系統(tong)發(fa)育(yu)概況，本文(wen)對207株KL47和319株KL64進行了(le)全基(ji)因(yin)(yin)組測序，發(fa)現(xian)其中(zhong)(zhong)>99%(523/526)屬(shu)于(yu)ST11類型(xing)(xing)(xing)，基(ji)于(yu)kleborate預測，發(fa)現(xian)ST11的(de)(de)44個K型(xing)(xing)(xing)和6個O型(xing)(xing)(xing)具有很強的(de)(de)相關性(xing)(xing)，其中(zhong)(zhong)L1的(de)(de)相關性(xing)(xing)最強。ST11中(zhong)(zhong)最常(chang)見的(de)(de)碳(tan)青霉(mei)烯酶是(shi)blaKPC-2，其次是(shi)blaOXA-48和blaNDM-1(圖(tu)3a)。基(ji)于(yu)上述(shu)系統(tong)發(fa)育(yu)，利用BactDating估(gu)計了(le)L1譜系的(de)(de)時(shi)空(kong)動(dong)態，推測了(le)L1的(de)(de)最近共同祖(zu)先在(zai)1983年(nian)之前出(chu)現(xian)在(zai)血清(qing)型(xing)(xing)(xing)KL47:OL101中(zhong)(zhong)，而(er)KL64:O2血清(qing)型(xing)(xing)(xing)估(gu)計在(zai)2003年(nian)出(chu)現(xian)，值得注(zhu)意(yi)的(de)(de)是(shi)，本文(wen)還預測了(le)L1中(zhong)(zhong)的(de)(de)其他14個K基(ji)因(yin)(yin)型(xing)(xing)(xing)，其中(zhong)(zhong)一些形成了(le)局部聚集（圖(tu)3b）。通過預測發(fa)現(xian)北京(jing)和上海是(shi)兩個主要傳播源(yuan)（圖(tu)3c和d）。 圖3 ST11菌株的(de)(de)群(qun)體結(jie)構(gou)和L1系的(de)(de)傳播模(mo)式 4.在(zai)KL64和KL47分離株(zhu)中存在(zai)非莢膜的(de)CRKP 所有經基(ji)(ji)(ji)因(yin)分型(xing)(xing)鑒定(ding)為KL64或KL47的(de)分離(li)(li)株均(jun)進(jin)行血(xue)清(qing)學分型(xing)(xing)，分別有7.4%(38/513)的(de)KL64和(he)(he)12.2%(32/263)的(de)KL47分離(li)(li)株在(zai)Quellung反(fan)應(ying)中不與相應(ying)的(de)抗血(xue)清(qing)發生反(fan)應(ying)，這(zhe)些分離(li)(li)株呈半(ban)透明狀(zhuang)，多(duo)糖膠囊脲醛酸顯著(zhu)減少(圖(tu)4a)，電鏡(jing)下證(zheng)實為NEKp菌(jun)株(圖(tu)4b)。NEKp的(de)頻率在(zai)不同身體(ti)部(bu)位的(de)樣本之間也沒有顯著(zhu)差(cha)異（圖(tu)4c）。NEKp菌(jun)株的(de)cps區或rfaH基(ji)(ji)(ji)因(yin)存在(zai)多(duo)種突(tu)變，包括插(cha)入(ru)序列(lie)(ISs)、點突(tu)變和(he)(he)缺(que)失，主要影響初始糖基(ji)(ji)(ji)轉移酶基(ji)(ji)(ji)因(yin)（圖(tu)4d）。此外，對49份(fen)未經處理(li)的(de)CRKP感染臨(lin)床樣本進(jin)行了宏基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)測序。在(zai)11個覆(fu)蓋(gai)率大于5倍的(de)樣本中，有3個樣本的(de)cps基(ji)(ji)(ji)因(yin)被破壞，這(zhe)證(zheng)明了體(ti)內存在(zai)莢膜(mo)缺(que)陷(xian)的(de)突(tu)變（圖(tu)4e）。 圖4 臨床分離株中莢膜(mo)缺陷的情(qing)況 5.在感染下NEKp菌株的特性分析(xi) 在體外和體內(nei)比較了(le)NEKp/莢(jia)膜(mo)缺陷(xian)菌(jun)株(zhu)(zhu)和EKp(莢(jia)膜(mo)肺炎克雷伯菌(jun))菌(jun)株(zhu)(zhu)，以評估莢(jia)膜(mo)合成對適應度的影(ying)響。結果發(fa)現，莢(jia)膜(mo)缺陷(xian)菌(jun)株(zhu)(zhu)生物(wu)膜(mo)生成增(zeng)加，同時對巨噬(shi)細胞吞噬(shi)的敏感性更高（圖5a-c）。小鼠腹膜(mo)內(nei)感染實驗表明，同基因型(xing)的Δcps突變株(zhu)(zhu)相比于其親(qin)本EKp菌(jun)株(zhu)(zhu)，在致死(si)率及向肺部(bu)、肝臟和脾臟擴散的競爭(zheng)能力方面均有所減(jian)弱（圖5d-h）。 圖5 評估莢膜合成對體外及體內適應性影響的(de)效(xiao)果 出(chu)人(ren)意料的(de)(de)(de)是(shi)，血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)殺菌(jun)(jun)實驗揭示NEKp菌(jun)(jun)株(zhu)中耐(nai)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)株(zhu)的(de)(de)(de)比(bi)例高于EKp菌(jun)(jun)株(zhu)（圖(tu)6a）,此(ci)外(wai)，我們發(fa)現除O-抗(kang)原(yuan)陰性(xing)(xing)(xing)株(zhu)外(wai)，與去(qu)莢(jia)(jia)膜(mo)(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)EKp菌(jun)(jun)株(zhu)相(xiang)比(bi)，同(tong)基(ji)因(yin)型Δcps突(tu)(tu)變株(zhu)表(biao)現出(chu)更(geng)強(qiang)的(de)(de)(de)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)耐(nai)受性(xing)(xing)(xing)和(he)增強(qiang)的(de)(de)(de)O抗(kang)原(yuan)表(biao)達(da)。通(tong)過(guo)比(bi)較親本EKp菌(jun)(jun)株(zhu)、莢(jia)(jia)膜(mo)(mo)(mo)(mo)多(duo)(duo)糖降(jiang)解酶處理過(guo)的(de)(de)(de)（去(qu)莢(jia)(jia)膜(mo)(mo)(mo)(mo)）EKp菌(jun)(jun)株(zhu)、同(tong)基(ji)因(yin)型Δcps及ΔcpsΔops突(tu)(tu)變株(zhu)的(de)(de)(de)抗(kang)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)能(neng)力(li)，證明了(le)莢(jia)(jia)膜(mo)(mo)(mo)(mo)多(duo)(duo)糖（CPS）與O-抗(kang)原(yuan)多(duo)(duo)糖（OPS）在(zai)抵抗(kang)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)殺傷(shang)中都起著關鍵作(zuo)用（圖(tu)6b）。轉錄組學分析及RT-PCR也(ye)顯(xian)示（圖(tu)7），相(xiang)較于親本菌(jun)(jun)株(zhu)，Δcps突(tu)(tu)變株(zhu)中LPS和(he)肽聚(ju)糖合(he)成(cheng)相(xiang)關基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)表(biao)達(da)上調(diao)。這些結(jie)果表(biao)明，莢(jia)(jia)膜(mo)(mo)(mo)(mo)合(he)成(cheng)的(de)(de)(de)破壞增強(qiang)了(le)O-抗(kang)原(yuan)的(de)(de)(de)合(he)成(cheng)，最(zui)終提高了(le)對(dui)抗(kang)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)的(de)(de)(de)能(neng)力(li)。此(ci)外(wai)，在(zai)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)殺菌(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)（SBA）試(shi)驗中，突(tu)(tu)變株(zhu)對(dui)從感染克雷伯(bo)氏肺炎菌(jun)(jun)KL47/KL64的(de)(de)(de)患者體內(nei)收集的(de)(de)(de)熱滅活(huo)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)顯(xian)示出(chu)更(geng)高的(de)(de)(de)抵抗(kang)力(li)，這提示莢(jia)(jia)膜(mo)(mo)(mo)(mo)耗竭可能(neng)是(shi)逃避體液免疫反應(ying)的(de)(de)(de)一種潛在(zai)機制(zhi)（圖(tu)6c）。總(zong)體而言，NEKp菌(jun)(jun)株(zhu)通(tong)過(guo)增強(qiang)生物膜(mo)(mo)(mo)(mo)形成(cheng)、提高血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)耐(nai)受性(xing)(xing)(xing)和(he)抗(kang)血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)殺菌(jun)(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)展現出(chu)適應(ying)性(xing)(xing)(xing)優勢，但在(zai)傳(chuan)播能(neng)力(li)和(he)抗(kang)吞噬作(zuo)用上存在(zai)缺(que)陷(xian)（圖(tu)6d）。 圖6 NEKp菌(jun)株(zhu)在感(gan)染壓力下具有生存優勢 圖(tu)7 WT和(he)Δcps菌株的RNA測序和(he)qPCR
04、結 論 本文描述(shu)(shu)了(le)中國為期五年的(de)多(duo)中心CRKP相(xiang)關感(gan)染監測，并全面概述(shu)(shu)了(le)CRKP菌株的(de)莢膜、耐藥性以及(ji)關鍵毒力(li)特征(zheng)的(de)分布與演變情(qing)況。同時，還闡(chan)述(shu)(shu)了(le)一種CRKP的(de)平衡進化過(guo)程，這一過(guo)程導致臨床樣(yang)本中維(wei)持了(le)中等(deng)但相(xiang)對穩定(ding)的(de)無莢膜及(ji)O-抗原缺失(shi)菌株水(shui)平。
原文索引： //doi. org/10.1016/j.scitotenv.2024.171457
