2024-09-08
近(jin)日，武漢大(da)學(xue)中(zhong)(zhong)南醫院在(zai)《communications biology》期刊發(fa)(fa)表新研究(jiu)成果！本研究(jiu)闡明(ming)了攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基(ji)因的(de)(de)(de)(de)超易傳播的(de)(de)(de)(de)lncM1質粒pKPC_NDM在(zai)序列型1049 K_locus 5 (ST1049-KL5) KPC_NDM_CRKP分離(li)株(zhu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)流(liu)行情況。這項研究(jiu)總結了KPC_NDM_CRKP暴(bao)發(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)特點，并(bing)強調了持續監控(kong)和感染控(kong)制策略的(de)(de)(de)(de)重要(yao)性，以及應對ST1049型肺炎克雷伯菌所帶來的(de)(de)(de)(de)挑(tiao)戰。
本研究的測序和分(fen)析由上海派森諾(nuo)生物科(ke)技股(gu)份有限公司完成。
1、研究(jiu)背景
肺炎(yan)克雷伯(bo)菌(jun)是一(yi)種重(zhong)要的(de)機會致(zhi)(zhi)病菌(jun)，可導(dao)致(zhi)(zhi)高發(fa)病率(lv)和(he)(he)(he)死(si)亡率(lv)。碳青霉(mei)(mei)烯(xi)(xi)耐藥的(de)多種機制涉及碳青霉(mei)(mei)烯(xi)(xi)酶(mei)的(de)產生，其(qi)中肺炎(yan)克雷伯(bo)菌(jun)碳青霉(mei)(mei)烯(xi)(xi)酶(mei)(KPC)和(he)(he)(he)新德里金屬β-內(nei)酰胺(an)酶(mei)(NDM)是最(zui)常見(jian)的(de)兩種類型(xing)。KPC和(he)(he)(he)NDM碳青霉(mei)(mei)烯(xi)(xi)酶(mei)的(de)共同(tong)產生已被(bei)廣(guang)泛記錄在各種腸(chang)桿菌(jun)科(ke)物(wu)種中，這(zhe)些細菌(jun)對幾乎所有(you)常用的(de)β-內(nei)酰胺(an)/β-內(nei)酰胺(an)酶(mei)抑(yi)制劑(ji)組(zu)合和(he)(he)(he)碳青霉(mei)(mei)烯(xi)(xi)類具有(you)耐藥性(xing)。雖然氨基糖苷類、粘菌(jun)素和(he)(he)(he)替加(jia)環(huan)素等替代治(zhi)療(liao)方案(an)可能有(you)效(xiao)，但(dan)與這(zhe)些藥物(wu)相關的(de)腎毒性(xing)和(he)(he)(he)死(si)亡率(lv)增加(jia)的(de)潛在風險不(bu)容忽視。
2、研究材料與方法(fa)
1.實驗材料：9株產KPC和NDM碳(tan)青霉(mei)烯(xi)酶的肺炎(yan)克雷伯(bo)菌，其中包括4株ST1049 KPC_NDM_CRKP和5株ST11 KPC_NDM_CRKP
2.測序平(ping)臺：Pacbio +Illumina
3.分析(xi)內容：細菌完成圖(tu)、比較基因(yin)組圈圖(tu)、（easyfig）遺傳環境分析(xi)、cgMLST聚類、cgSNP進化(hua)樹構建、藥敏試驗、基因(yin)編輯、共軛和(he)適應度評(ping)價等等。
3、研究結果
肺炎克(ke)雷伯菌分離株(zhu)的克(ke)隆和遺傳相關(guan)性
脈沖(chong)場凝膠電(dian)泳分析顯示(shi)除KP4007菌(jun)株(zhu)外，所有ST1049型(xing)肺(fei)炎(yan)克(ke)雷(lei)伯菌(jun)分離株(zhu)之間具有高度克(ke)隆(long)相(xiang)關(guan)性(xing)。菌(jun)株(zhu)KP1527、KP2094和KP1078表現出相(xiang)同(tong)的電(dian)泳條(tiao)(tiao)帶，與初始分離株(zhu)KP3594僅相(xiang)差兩(liang)個條(tiao)(tiao)帶，表明ST1049型(xing)肺(fei)炎(yan)克(ke)雷(lei)伯菌(jun)在(zai)本(ben)院內(nei)的克(ke)隆(long)傳播。cgSNP系統發育樹(shu)進一(yi)步證(zheng)實了(le)這(zhe)些發現，顯示(shi)ST1049 KPC_NDM_CRKP菌(jun)株(zhu)之間存在(zai)緊密的遺(yi)傳關(guan)系，SNP變異(yi)最小。相(xiang)比之下，盡管(guan)ST11 KPC_NDM_CRKP群在(zai)系統發育圖譜中表現出遺(yi)傳同(tong)源(yuan)性(xing)，但在(zai)PFGE模式(shi)上顯示(shi)了(le)克(ke)隆(long)異(yi)質性(xing)。
圖1 臨床肺炎克雷伯菌(jun)克隆及遺傳親(qin)緣關系分析
ST1049 KPC_NDM_CRKP質粒(li)的(de)比較基因(yin)組分析
全基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組測序(xu)顯(xian)示(shi)KPC_NDM_CRKP分(fen)離株抗藥(yao)性和毒(du)(du)力基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)譜多樣(yang)性。blaKPC-2基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)位于IncFII/IncR質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)，而blaNDM-1在(zai)IncN或IncC質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)中。ST1049分(fen)離株攜帶76,517 bp的(de)(de)IncM1質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)pKPC_NDM，含(han)blaKPC-2、blaNDM-1和qnrS1基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)；一個IncFII(K)多重耐(nai)藥(yao)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)；以及(ji)編碼毒(du)(du)力因(yin)(yin)(yin)子(zi)的(de)(de)IncFIB質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)。pVIR1527質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)包含(han)高(gao)毒(du)(du)力質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)pLVPK和pK2044的(de)(de)毒(du)(du)力基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，與(yu)(yu)KPN55602的(de)(de)pK55602_1高(gao)度相似(si)。pKPC_NDM與(yu)(yu)CRKP_35_unnamed4相同。其他IncM1質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)攜帶blaKPC-2或blaCTX-M-3基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，pKPC_NDM1527含(han)接合相關移動遺(yi)傳元件。pKPC_NDM與(yu)(yu)NCBI數據庫中質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)比較，顯(xian)示(shi)blaKPC-2的(de)(de)保守(shou)性，blaNDM-1的(de)(de)多樣(yang)性。具體來說，pKPC_NDM中的(de)(de)blaKPC-2區(qu)域與(yu)(yu)之前報道的(de)(de)在(zai)pKpc-LKEC中鑒(jian)定的(de)(de)NTEKPC-Id結構(gou)相似(si)，而blaNDM-1區(qu)域與(yu)(yu)IncN質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)pNDM1-CBG具有最高(gao)相似(si)性。
圖2 質粒比較基(ji)因組(zu)分析
接合子/轉化(hua)子的(de)特性驗證以及pKPC_NDM的(de)轉移能力
pKPC_NDM從(cong)(cong)供體ST1049 KPC_NDM_CRKP菌(jun)株(zhu)向受(shou)體大腸桿菌(jun)EC600的(de)(de)成功轉移顯示了比ST11 KPC_NDM_CRKP攜帶的(de)(de)blaKPC-2或(huo)blaNDM-1質粒(li)更(geng)高(gao)的(de)(de)傳輸(shu)頻率。pKPC_NDM還可以從(cong)(cong)ST1049 KPC_NDM_CRKP轉移到對碳(tan)青(qing)霉烯(xi)敏感的(de)(de)肺炎(yan)克雷伯(bo)菌(jun)對照菌(jun)株(zhu)K. pneumoniae ATCC 700603，并從(cong)(cong)供體大腸桿菌(jun)EC600::pKPC_NDM轉移到ST1049 CSKP受(shou)體。同(tong)時(shi)試驗(yan)驗(yan)證(zheng)了野生(sheng)株(zhu)及其攜帶pKPC_NDM的(de)(de)接合(he)子/轉化子共同(tong)產生(sheng)KPC和NDM碳(tan)青(qing)霉烯(xi)酶。值得注意(yi)的(de)(de)是，氨曲南（ATM）和頭孢他(ta)啶/阿維巴坦（CAZ/AVI）紙片(pian)之間的(de)(de)幽靈區暗示了對攜帶pKPC_NDM菌(jun)株(zhu)的(de)(de)協同(tong)作用(yong)。
圖(tu)3 使用APB/EDTA增(zeng)強(qiang)方(fang)法進行碳(tan)青(qing)霉烯酶(mei)表型確認
對來源于pKPC_NDM的(de)oriT與(yu)數據庫進行比較(jiao)，結果顯示其與(yu)來自(zi)廣宿主范圍接合質(zhi)粒(li)pCTXM-360的(de)oriT_pCTXM360具(ju)有(you)(you)最(zui)高相(xiang)似性。進一步與(yu)從(cong)NCBI中(zhong)檢索出(chu)的(de)90個質(zhi)粒(li)進行比較(jiao)，所有(you)(you)這些質(zhi)粒(li)具(ju)有(you)(you)相(xiang)同的(de)oriTKN位點，表明oriTKN與(yu)IncM1接合質(zhi)粒(li)之(zhi)間有(you)(you)很強的(de)相(xiang)關性，其在IncM1質(zhi)粒(li)傳播中(zhong)的(de)關鍵作用。此(ci)外，oriTKN的(de)插入促進了(le)pUCP24從(cong)大腸桿菌(jun)(jun)S17到大腸桿菌(jun)(jun)EC600和肺炎克雷伯菌(jun)(jun)ATCC 700603的(de)自(zi)發接合。
pKPC_NDM受體中(zhong)的穩定性、不(bu)相容性及碳(tan)青霉(mei)烯(xi)抗性維(wei)持
質粒穩定性(xing)(xing)(xing)(xing)和適應(ying)性(xing)(xing)(xing)(xing)測(ce)(ce)試(shi)(shi)結(jie)果顯示(shi)，當pKPC_NDM通過接合(he)(he)引(yin)入到ST1049 CSKP受體和大(da)腸桿(gan)菌(jun)(jun)EC600中(zhong)(zhong)(zhong)時，經過連(lian)續10天的(de)(de)傳代后，其保留率(lv)超(chao)過80%，且(qie)(qie)這種穩定性(xing)(xing)(xing)(xing)并(bing)未(wei)損害其適應(ying)性(xing)(xing)(xing)(xing)。碳青(qing)(qing)霉(mei)烯(xi)抗(kang)(kang)性(xing)(xing)(xing)(xing)維持(chi)結(jie)果表(biao)明，在傳代過程中(zhong)(zhong)(zhong)128株大(da)腸桿(gan)菌(jun)(jun)受體中(zhong)(zhong)(zhong)有(you)3.9%和128株肺炎(yan)克雷伯菌(jun)(jun)受體中(zhong)(zhong)(zhong)有(you)2.3%失去(qu)了(le)碳青(qing)(qing)霉(mei)烯(xi)抗(kang)(kang)性(xing)(xing)(xing)(xing)，并(bing)且(qie)(qie)所有(you)這些(xie)菌(jun)(jun)株都(dou)失去(qu)了(le)整(zheng)(zheng)個(ge)pKPC_NDM質粒。有(you)趣(qu)的(de)(de)是(shi)，有(you)一(yi)個(ge)特定的(de)(de)接合(he)(he)子保持(chi)了(le)降低的(de)(de)碳青(qing)(qing)霉(mei)烯(xi)抗(kang)(kang)性(xing)(xing)(xing)(xing)但(dan)失去(qu)了(le)對頭孢他啶/阿維巴(ba)坦（CAZ/AVI）的(de)(de)抗(kang)(kang)性(xing)(xing)(xing)(xing)，測(ce)(ce)序結(jie)果顯示(shi)該接合(he)(he)子失去(qu)了(le)blaNDM-1基(ji)因(yin)區域。進一(yi)步(bu)實驗(yan)成功地使用CRISPR-Cas9方(fang)法敲除(chu)了(le)blaKPC-2基(ji)因(yin)，但(dan)是(shi)嘗試(shi)(shi)敲除(chu)blaNDM-1基(ji)因(yin)導致了(le)整(zheng)(zheng)個(ge)pKPC_NDM質粒在宿主(zhu)菌(jun)(jun)株中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)丟失。此外，含有(you)KPC或(huo)NDM區域缺失的(de)(de)質粒與pKPC_NDM相(xiang)比，在接合(he)(he)效率(lv)上(shang)沒(mei)有(you)顯著差異。在不相(xiang)容性(xing)(xing)(xing)(xing)測(ce)(ce)試(shi)(shi)中(zhong)(zhong)(zhong)，pKPC_NDM與KPC-或(huo)NDM產生的(de)(de)CRKP菌(jun)(jun)株中(zhong)(zhong)(zhong)存在的(de)(de)IncFII/IncR blaKPC-2和IncN或(huo)IncC blaNDM-1質粒相(xiang)容，在不含抗(kang)(kang)生素的(de)(de)平板(ban)上(shang)培養后，所有(you)轉化子菌(jun)(jun)落都(dou)保留了(le)pKPC_NDM以(yi)及(ji)攜帶blaKPC-2或(huo)blaNDM-1的(de)(de)質粒。
藥敏實驗結果
KPC_NDM_CRKP菌株對臨(lin)床(chuang)使用的(de)(de)β-內(nei)酰胺(an)類抗(kang)生(sheng)素(su)均(jun)表現(xian)出抗(kang)性，包括頭孢菌素(su)、單環β-內(nei)酰胺(an)、β-內(nei)酰胺(an)/β-內(nei)酰胺(an)酶抑制劑組合以及碳(tan)青(qing)霉烯類抗(kang)生(sheng)素(su)。然而，它們對多粘菌素(su)B和替加環素(su)仍保(bao)持敏(min)感，并且對氨(an)基糖苷類、喹諾酮類和復方磺(huang)胺(an)甲噁唑顯示(shi)不(bu)同(tong)的(de)(de)抗(kang)性模(mo)式。雖然CAZ/AVI的(de)(de)有(you)效性有(you)限，但AVI與ATM或(huo)美西林（MEC）的(de)(de)聯合療法(fa)對抗(kang)KPC_NDM_CRKP菌株顯示(shi)出顯著改善(shan)。此(ci)外(wai)，當刪除攜帶(dai)blaKPC或(huo)blaNDM的(de)(de)區(qu)域時，觀察到碳(tan)青(qing)霉烯MIC值降低(di)了兩倍。
致病性評(ping)估和(he)時間殺滅試驗結(jie)果
大(da)多數KPC_NDM_CRKP分離株對(dui)人血(xue)清表現(xian)出高度(du)敏感性(xing)。然而，ST1049肺炎(yan)(yan)克雷伯菌的(de)整體生(sheng)物(wu)膜產量(liang)顯(xian)(xian)(xian)著高于ST11肺炎(yan)(yan)克雷伯菌菌株。雖然ST1049 KPC_NDM_CRKP和CSKP組之間在生(sheng)物(wu)膜形成能(neng)力方面沒(mei)有顯(xian)(xian)(xian)著差(cha)異，前者表現(xian)出增強的(de)抗血(xue)清殺(sha)菌能(neng)力。時間殺(sha)滅試驗顯(xian)(xian)(xian)示單獨使(shi)用CAZ/AVI、ATM或MEC對(dui)KPC_NDM_CRKP菌株的(de)體外療(liao)效(xiao)有限，而聯合療(liao)法(fa)顯(xian)(xian)(xian)示出協同效(xiao)應。
圖4臨床肺炎克雷伯菌致病性特征(zheng)及時間(jian)殺傷曲線
核(he)心基因(yin)組多位點序列分(fen)型（cgMLST）分(fen)析
對23株ST1049菌株和(he)115株其(qi)他(ta)序列類型的(de)(de)KPC_NDM_CRKP菌株在(zai)內(nei)的(de)(de)肺炎克雷伯菌基因組(zu)進行cgMLST分(fen)析(xi)。分(fen)析(xi)表(biao)明(ming)ST1049流行主要局(ju)限(xian)于中國地區(qu)，并且在(zai)KPC_NDM_CRKP菌株之間表(biao)現(xian)出顯(xian)著的(de)(de)多樣性(xing)。KPC_NDM_CRKP的(de)(de)流行包括(kuo)幾個成功的(de)(de)克隆，這表(biao)明(ming)其(qi)基因組(zu)和(he)地理上的(de)(de)異質性(xing)。有趣的(de)(de)是(shi)，ST1049 KPC_NDM_CRKP的(de)(de)爆發最初(chu)且僅在(zai)我院觀察到。
圖5 cgMLST分析(xi)
4、結 論
攜(xie)帶同時含有(you)blaKPC-2和blaNDM-1基因的(de)IncM1質粒pKPC_NDM的(de)ST1049-KL5型碳青霉烯耐(nai)藥肺炎克雷(lei)伯菌(jun)（CRKP）的(de)出現及其克隆傳(chuan)播提出了(le)嚴峻的(de)公共健康(kang)問題。本研究強(qiang)調了(le)ST1049菌(jun)株作(zuo)為高毒力(li)和多重耐(nai)藥質粒載體的(de)潛力(li)，突顯了(le)持續監測和實施有(you)效(xiao)感染控制策略的(de)重要性。
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文章(zhang)索(suo)引：
Liu, Hongmao, et al. "Prevalence of ST1049-KL5 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with a blaKPC-2 and blaNDM-1 co-carrying hypertransmissible IncM1 plasmid." Communications Biology 7.1 (2024): 695.
