非傷寒沙門氏菌（NTS）是(shi)一(yi)種革蘭氏陰性、兼性厭氧(yang)、不(bu)(bu)產孢桿菌，屬于腸桿菌科，是(shi)全球最常(chang)見的(de)急性胃(wei)腸炎(yan)病原體之一(yi)。大多數由(you)(you)NTS引(yin)起的(de)人類胃(wei)腸炎(yan)病例是(shi)自限(xian)性的(de)腹瀉(xie)疾(ji)病，不(bu)(bu)需要(yao)使(shi)用(yong)抗生素治(zhi)療(liao)。但隨著抗生素的(de)過度使(shi)用(yong)和選(xuan)擇壓(ya)力以(yi)及人類不(bu)(bu)合理使(shi)用(yong)抗菌藥物，NTS出現耐(nai)藥性變(bian)得加速。NTS耐(nai)藥性主要(yao)由(you)(you)與(yu)酶修(xiu)飾、能量依賴性外排、靶點(dian)保護和細(xi)菌細(xi)胞(bao)壁變(bian)化(hua)相關的(de)耐(nai)藥基因(yin)介導。因(yin)此，有必要(yao)研究NTS的(de)耐(nai)藥基因(yin)組成和分布，以(yi)減緩(huan)AMR的(de)發展。

8株引起人類急性胃腸炎的NTS菌株

Illumina Novaseq+Nanopore

細菌(jun)基因組完成圖、cgMLST分析(xi)、質(zhi)粒復制子類(lei)型(xing)分析(xi)、血清型(xing)分析(xi)等

總共收集(ji)了(le)153份疑似(si)急性食源(yuan)性胃腸炎患者(zhe)的標本，并從中分(fen)離出了(le)來(lai)自8名患者(zhe)的8株NTS。血清型分(fen)析(xi)表(biao)明，在(zai)這8株菌中鼠(shu)傷寒血清型最為普(pu)遍(bian)，其余(yu)菌株的血清型分(fen)別(bie)為Goldcoast、London、Enteritidis、Potsdam以(yi)及1,4,[5],12:i:?。

表(biao)1 血(xue)清型分析(xi)結果

基于cgMLST分型(xing)結果構建了一(yi)個包含13株沙(sha)(sha)門(men)氏(shi)菌(jun)(jun)的最(zui)小生成樹，三株鼠傷(shang)寒沙(sha)(sha)門(men)氏(shi)菌(jun)(jun)ST19（XSK、CHC和ZCX）與從(cong)揚州(zhou)市(shi)一(yi)名(ming)腹瀉患者中分離出的鼠傷(shang)寒沙(sha)(sha)門(men)氏(shi)菌(jun)(jun)ST34 YZU0175以及(ji)單相變種S. 1,4,[5],12:i:? ST34 ZLQ具(ju)有最(zui)近(jin)的進化關系。

圖1 cgMLST聚類樹圖

測序共預測出76個獲得性耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)基(ji)因(yin)，有40個位于(yu)質粒上，其余位于(yu)染色體(ti)上。耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)基(ji)因(yin)分別(bie)為AAC(6')-Iaa（10.5%）、TEM-1（7.9%）、sul2（6.6%）、tet(A)（5.3%）。耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)的抗(kang)生素類別(bie)為氨基(ji)糖苷類（30.3%）、磺胺(an)類（13.2%）、β-內酰胺(an)類和四(si)環素類（各(ge)9.2%）。在8株(zhu)(zhu)(zhu)NTS中檢測到(dao)了耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)基(ji)因(yin)，其中CHC菌(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)擁(yong)有最多(duo)的耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)基(ji)因(yin)（17個），其次(ci)是FFL菌(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)（15個）、ZCX菌(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)（13個）以及XSK菌(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)（13個）。

藥(yao)敏實驗結(jie)果顯(xian)示，表(biao)型(xing)抗性與已(yi)知(zhi)的(de)AMR決定(ding)因(yin)素(su)(su)的(de)存在密切(qie)相(xiang)關(guan)。在預測三類抗生素(su)(su)的(de)耐(nai)(nai)藥(yao)性方面，所檢測到(dao)的(de)耐(nai)(nai)藥(yao)基(ji)(ji)因(yin)的(de)整體靈敏度為(wei)100%（78.5%-100%），特(te)異性為(wei)80%（49.0%-94.3%），Kappa值為(wei)0.8（0.4-1.0）。在這些基(ji)(ji)因(yin)中，與氨(an)芐青霉素(su)(su)耐(nai)(nai)藥(yao)相(xiang)關(guan)的(de)基(ji)(ji)因(yin)具(ju)有(you)最強的(de)預測耐(nai)(nai)藥(yao)表(biao)型(xing)的(de)能力。

在8株(zhu)NTS中(zhong)共檢(jian)測到18個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)，其中(zhong)ZYX含有(you)(you)6個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)、CHC和CYX各含有(you)(you)4個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)、FFL以(yi)及ZCX各含有(you)(you)2個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)。有(you)(you)6個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)被鑒定為可移動(dong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)，3個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)為接(jie)合質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)，其余為不(bu)可傳遞質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)。復制子分型(xing)分析顯示，可移動(dong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)包括三個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)Col(pHAD28)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)、兩個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)Col440I質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)和一(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)ColRNAI質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)。接(jie)合質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)包括一(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)IncHI2質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)，一(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)IncFIB(S)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)，以(yi)及一(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)IncI1-I(Alpha)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)。在8個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)中(zhong)共鑒定了40個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)耐藥基因，有(you)(you)12個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基因在2個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)接(jie)合質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)上(shang)，其余基因則分布在6個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)不(bu)可傳遞質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)中(zhong)。

CHC、XSK和(he)(he) ZLQ的(de)(de)(de)染(ran)(ran)色體(ti)(ti)上(shang)共鑒定了(le)(le)11個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)攜帶(dai)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)移動遺傳元(yuan)件（MGEs），這些MGEs包(bao)括三個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)島、六個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)復(fu)(fu)(fu)合轉座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)和(he)(he)兩個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)整(zheng)合子(zi)。具(ju)體(ti)(ti)來說，CHC菌株(zhu)染(ran)(ran)色體(ti)(ti)上(shang)攜帶(dai)了(le)(le)1個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)島、2個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)復(fu)(fu)(fu)合轉座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)和(he)(he)1個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)整(zheng)合子(zi)，共有10個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)基因(yin)(yin)位(wei)于這些MGEs中(zhong)。CHC菌株(zhu)染(ran)(ran)色體(ti)(ti)上(shang)還(huan)含(han)有另(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)由IS15DI側翼包(bao)圍(wei)的(de)(de)(de)復(fu)(fu)(fu)合轉座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)，該轉座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)包(bao)含(han)六個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)ISs和(he)(he)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)QnrS1基因(yin)(yin)。XSK菌株(zhu)染(ran)(ran)色體(ti)(ti)上(shang)攜帶(dai)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)MGEs與CHC菌株(zhu)相似(si)，但多了(le)(le)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)tet(A)基因(yin)(yin)、一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)IS（TnpA_TnAs1）以(yi)及(ji)位(wei)于耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)島內的(de)(de)(de)復(fu)(fu)(fu)合轉座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)中(zhong)的(de)(de)(de)另(ling)外三個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基因(yin)(yin)。ZLQ菌株(zhu)染(ran)(ran)色體(ti)(ti)上(shang)攜帶(dai)五個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)基因(yin)(yin)，位(wei)于兩個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)復(fu)(fu)(fu)合轉座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)上(shang)：其中(zhong)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)包(bao)含(han)四(si)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)基因(yin)(yin)和(he)(he)五個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)ISs，另(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)攜帶(dai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)tet(B)基因(yin)(yin)和(he)(he)四(si)個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)ISs。這些耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)基因(yin)(yin)及(ji)相關(guan)MGEs構成了(le)(le)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)島的(de)(de)(de)主要(yao)結構。

圖3 質(zhi)粒和染色體(ti)上MGE分(fen)布情況(kuang)

攜帶(dai)耐藥基(ji)因的MGEs在質粒上(shang)的分(fen)析 

在(zai)7個(ge)(ge)(ge)(ge)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)上鑒定13個(ge)(ge)(ge)(ge)攜(xie)(xie)帶(dai)(dai)(dai)(dai)耐(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)的(de)(de)移(yi)(yi)動遺傳元件，包(bao)(bao)括(kuo)10個(ge)(ge)(ge)(ge)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)和(he)(he)3個(ge)(ge)(ge)(ge)整(zheng)合(he)(he)子(zi)(zi)(zi)。質(zhi)(zhi)粒(li)(li)中(zhong)攜(xie)(xie)帶(dai)(dai)(dai)(dai)最多MGEs的(de)(de)是(shi)pFFL-2，其(qi)次是(shi)pZCX-1和(he)(he)pZYX-1。非(fei)移(yi)(yi)動質(zhi)(zhi)粒(li)(li)pCYX-1攜(xie)(xie)帶(dai)(dai)(dai)(dai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)非(fei)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)，包(bao)(bao)含(han)(han)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)TEM-1基(ji)因(yin)，而非(fei)移(yi)(yi)動質(zhi)(zhi)粒(li)(li)pCYX-2攜(xie)(xie)帶(dai)(dai)(dai)(dai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)由Tn3和(he)(he)IS26側翼包(bao)(bao)圍(wei)(wei)的(de)(de)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)，包(bao)(bao)含(han)(han)四個(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)。pFFL-2攜(xie)(xie)帶(dai)(dai)(dai)(dai)的(de)(de)14個(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)分布在(zai)3個(ge)(ge)(ge)(ge)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)中(zhong)，其(qi)中(zhong)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)內包(bao)(bao)含(han)(han)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)含(han)(han)有6個(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)的(de)(de)單一(yi)(yi)整(zheng)合(he)(he)子(zi)(zi)(zi)。總共有10個(ge)(ge)(ge)(ge)插入序列（ISs）參與了這三(san)個(ge)(ge)(ge)(ge)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)形成，其(qi)中(zhong)IS26占據了60%。從ZCX菌株中(zhong)分離(li)出的(de)(de)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)接合(he)(he)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)pZCX-1和(he)(he)pZCX-2分別含(han)(han)有三(san)個(ge)(ge)(ge)(ge)和(he)(he)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)MGEs。pZCX-1的(de)(de)MGEs包(bao)(bao)括(kuo)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)和(he)(he)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)整(zheng)合(he)(he)子(zi)(zi)(zi)，八(ba)個(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)分布在(zai)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)中(zhong)。pZCX-2中(zhong)的(de)(de)MGE是(shi)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)，攜(xie)(xie)帶(dai)(dai)(dai)(dai)四個(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)，包(bao)(bao)括(kuo)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)由IS26側翼包(bao)(bao)圍(wei)(wei)的(de)(de)QnrS2基(ji)因(yin)，以及由IS15DI側翼包(bao)(bao)圍(wei)(wei)的(de)(de)OqxA和(he)(he)OqxB基(ji)因(yin)。pCHC-1上的(de)(de)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)攜(xie)(xie)帶(dai)(dai)(dai)(dai)五個(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)，這些基(ji)因(yin)與鼠(shu)傷(shang)寒(han)沙門氏菌CHC染色體上的(de)(de)那些不(bu)同。pZYX-1上的(de)(de)復(fu)合(he)(he)轉(zhuan)座(zuo)子(zi)(zi)(zi)攜(xie)(xie)帶(dai)(dai)(dai)(dai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)整(zheng)合(he)(he)子(zi)(zi)(zi)，包(bao)(bao)含(han)(han)三(san)個(ge)(ge)(ge)(ge)耐(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)：dfrB4、qacE和(he)(he)sul1。

在8株NTS中總共鑒定了277個ISs，其中211個位(wei)于(yu)(yu)染(ran)(ran)色體(ti)上(shang)(shang)(shang)，66個位(wei)于(yu)(yu)質粒(li)上(shang)(shang)(shang)。檢出(chu)率最高(gao)的(de)ISs是(shi)ISEch5，其次是(shi)IS26（11.2%）、ISEhe3和ISSen1。ISEch5和ISSen1僅在染(ran)(ran)色體(ti)上(shang)(shang)(shang)檢測到，而在質粒(li)上(shang)(shang)(shang)檢出(chu)率最高(gao)的(de)IS是(shi)IS26。在277個ISs中，25%參(can)與了復合轉(zhuan)座(zuo)子的(de)形成，包(bao)括染(ran)(ran)色體(ti)上(shang)(shang)(shang)的(de)38個ISs和質粒(li)上(shang)(shang)(shang)的(de)32個ISs。其中，IS26是(shi)最常見的(de)構成復合轉(zhuan)座(zuo)子的(de)IS，其次是(shi)IS15DI和ISKpn26。

圖(tu)4 ISs的組成(cheng)和分(fen)布

ZLQ菌株染(ran)色體上檢測到一(yi)個(ge)長度為(wei)80,793 bp的ICE，由87個(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組成(cheng)，包括(kuo)24個(ge)與(yu)IV型分(fen)泌系統相關的基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)、2個(ge)編碼(ma)relaxase的基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)、1個(ge)編碼(ma)整(zheng)(zheng)合(he)(he)酶的基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)、1個(ge)編碼(ma)耦合(he)(he)蛋(dan)白(bai)(bai)至IV型接合(he)(he)蛋(dan)白(bai)(bai)復合(he)(he)物的基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，以(yi)及59個(ge)編碼(ma)其他蛋(dan)白(bai)(bai)質的基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)。在(zai)五株NTS中(zhong)總(zong)共鑒(jian)定了五個(ge)整(zheng)(zheng)合(he)(he)或(huo)可移(yi)動元件（IMEs）：CHC、XSK、ZCX、YZY和FFL。每個(ge)IME都含(han)有兩個(ge)重要的基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，即編碼(ma)整(zheng)(zheng)合(he)(he)酶和relaxase的基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，其中(zhong)relaxase主要屬于MobH家族(zu)。

圖5 ICEs 和IMEs鑒定(ding)

在(zai)(zai)8株NTS中總(zong)共檢測到21個(ge)(ge)(ge)完(wan)整的(de)前噬(shi)菌(jun)(jun)體(ti)(ti)區域，其中含有最(zui)多前噬(shi)菌(jun)(jun)體(ti)(ti)的(de)分離株是(shi)ZLQ和(he)(he)ZCX，其次是(shi)ZYX、FFL和(he)(he)CYX（各三(san)個(ge)(ge)(ge)），CHC（兩個(ge)(ge)(ge)），以及YZY和(he)(he)XSK（各一個(ge)(ge)(ge)）。在(zai)(zai)這些完(wan)整的(de)前噬(shi)菌(jun)(jun)體(ti)(ti)中，最(zui)常見的(de)類型是(shi)Phage_Gifsy_2、Salmon_118970_sal3和(he)(he)Phage_Gifsy_1。

圖(tu)6 噬菌(jun)體區鑒定