1、研(yan)究背景

染(ran)(ran)色(se)質(zhi)重塑子ARID1A通(tong)過調節核小體定位和(he)染(ran)(ran)色(se)質(zhi)可及性來(lai)調節基因轉錄。而在細胞命運通(tong)路中，ARID1A介導的階段和(he)譜系限制(zhi)基因調控仍未(wei)得(de)到(dao)解決。

2、研(yan)究方法

3、研究路(lu)線

4、研究結果

進一步分析3周齡(ling)成(cheng)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)、破(po)(po)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)功能(neng)改變(bian)情況。TRAP染(ran)(ran)色(se)(se)顯(xian)示敲(qiao)(qiao)除(chu)鼠破(po)(po)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)細(xi)(xi)(xi)胞定量(liang)減少；甲(jia)苯(ben)安(an)藍染(ran)(ran)色(se)(se)顯(xian)示成(cheng)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)細(xi)(xi)(xi)胞定量(liang)減少；GRB染(ran)(ran)色(se)(se)顯(xian)示類骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)質定量(liang)相似；MASSON染(ran)(ran)色(se)(se)顯(xian)示敲(qiao)(qiao)除(chu)鼠股骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)遠端生(sheng)長板下存在大量(liang)未吸(xi)收的鈣化(hua)(hua)軟(ruan)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)；骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)髓(sui)單核(he)細(xi)(xi)(xi)胞體(ti)外破(po)(po)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)誘導TRAP染(ran)(ran)色(se)(se)顯(xian)示敲(qiao)(qiao)除(chu)鼠TRAP陽(yang)性(xing)破(po)(po)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)細(xi)(xi)(xi)胞數量(liang)減少，體(ti)積變(bian)小；血清骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)吸(xi)收（TRAP/CTX-I）和骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)形(xing)成(cheng)標志物(wu)（OCN/PINP），破(po)(po)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)指(zhi)標蛋白qPCR，WB（MMP9，CTSK）顯(xian)示，敲(qiao)(qiao)除(chu)鼠骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)吸(xi)收被抑(yi)(yi)制，骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)形(xing)成(cheng)能(neng)力無顯(xian)著變(bian)化(hua)(hua)。結果表明ARID1A敲(qiao)(qiao)除(chu)鼠骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)量(liang)增(zeng)加，破(po)(po)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)抑(yi)(yi)制。ARID1A對于正常的破(po)(po)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)分化(hua)(hua)至關重要。（圖2）

為了(le)分(fen)(fen)析(xi)(xi)ARID1A對(dui)于破(po)骨(gu)(gu)(gu)分(fen)(fen)化作用的(de)(de)(de)(de)內在(zai)機制，對(dui)ARID1A缺(que)(que)(que)(que)失的(de)(de)(de)(de)骨(gu)(gu)(gu)髓細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)進行24小(xiao)時的(de)(de)(de)(de)破(po)骨(gu)(gu)(gu)誘導(dao)后(hou)(hou)做單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)轉錄組測(ce)序(xu)(scRNA-Seq)。對(dui)照組5813個(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，敲除組5305個(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，聚類分(fen)(fen)析(xi)(xi)出11個(ge)聚類。其(qi)中簇(cu)(cu)(cu)3具有高表達(da)的(de)(de)(de)(de)破(po)骨(gu)(gu)(gu)相關(guan)基(ji)因，說明簇(cu)(cu)(cu)3是(shi)破(po)骨(gu)(gu)(gu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)前體(ti)。其(qi)余（簇(cu)(cu)(cu)1，8,9,5,6,7,0）主要是(shi)單(dan)(dan)核(he)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，簇(cu)(cu)(cu)2,4主要是(shi)增殖(zhi)群(qun)體(ti)，簇(cu)(cu)(cu)10為中性粒細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)標(biao)記(ji)。比(bi)(bi)較各個(ge)聚類細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)簇(cu)(cu)(cu)比(bi)(bi)例，發現簇(cu)(cu)(cu)5、0和(he)2的(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例增加，而(er)簇(cu)(cu)(cu)4和(he)3的(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例減少(shao)，說明ARID1A的(de)(de)(de)(de)缺(que)(que)(que)(que)失缺(que)(que)(que)(que)失影(ying)響了(le)破(po)骨(gu)(gu)(gu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)化。隨后(hou)(hou)進行偽(wei)時間(jian)分(fen)(fen)析(xi)(xi)，單(dan)(dan)核(he)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)通過逐(zhu)步途徑分(fen)(fen)化為OC前體(ti)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，單(dan)(dan)核(he)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)標(biao)記(ji)物Lgmn、Csf1r和(he)Ccl2表達(da)水平逐(zhu)漸(jian)下(xia)調，破(po)骨(gu)(gu)(gu)基(ji)因Ctsk、Mmp9和(he)Acp5表達(da)逐(zhu)漸(jian)增高，增殖(zhi)標(biao)記(ji)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)表達(da)水平在(zai)中期達(da)到峰(feng)值。對(dui)比(bi)(bi)敲除組和(he)對(dui)照組的(de)(de)(de)(de)偽(wei)時間(jian)分(fen)(fen)析(xi)(xi)，發現ARID1A缺(que)(que)(que)(que)失后(hou)(hou)，單(dan)(dan)核(he)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)從增殖(zhi)到分(fen)(fen)化的(de)(de)(de)(de)過程(cheng)受到阻礙。體(ti)內體(ti)外EDU示(shi)蹤標(biao)記(ji)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)實驗顯示(shi)ARID1A缺(que)(que)(que)(que)失組，EUD陽性的(de)(de)(de)(de)CTSK+或者TRAP+細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)很(hen)少(shao)。結(jie)果表明在(zai)增殖(zhi)分(fen)(fen)化的(de)(de)(de)(de)過渡(du)過程(cheng)中，ARID1A對(dui)于保護(hu)管道化是(shi)必不(bu)可少(shao)的(de)(de)(de)(de)，而(er)在(zai)破(po)骨(gu)(gu)(gu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)發生過程(cheng)中，ARID1A的(de)(de)(de)(de)缺(que)(que)(que)(que)失會導(dao)致細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)命運承諾的(de)(de)(de)(de)缺(que)(que)(que)(que)陷。（圖(tu)3）

為了進一步研(yan)(yan)究ARID1A介導的(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)調控機(ji)制，重點研(yan)(yan)究了ARID1A缺(que)失(shi)(shi)后分(fen)(fen)化(hua)軌跡中(zhong)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)譜(pu)的(de)(de)變化(hua)。KEGG富(fu)(fu)集(ji)分(fen)(fen)析(xi)顯(xian)示(shi)，溶(rong)酶體、趨化(hua)因子信號(hao)通路和代謝(xie)途(tu)徑(jing)在(zai)簇5和簇0中(zhong)高度富(fu)(fu)集(ji)，細(xi)胞周(zhou)期(qi)和DNA復制在(zai)簇2中(zhong)富(fu)(fu)集(ji)，核糖(tang)體相關途(tu)徑(jing)在(zai)簇3中(zhong)高度富(fu)(fu)集(ji)，DNA復制和核糖(tang)體相關途(tu)徑(jing)在(zai)簇4中(zhong)都富(fu)(fu)集(ji)。偽時(shi)間分(fen)(fen)析(xi)和基(ji)于(yu)分(fen)(fen)區的(de)(de)圖抽(chou)象(PAGA)均顯(xian)示(shi)，增(zeng)殖-分(fen)(fen)化(hua)切換的(de)(de)關鍵細(xi)胞群(qun)簇4是Arid1a缺(que)失(shi)(shi)后的(de)(de)主動缺(que)陷細(xi)胞簇。然后分(fen)(fen)析(xi)了Arid1a缺(que)失(shi)(shi)后簇4轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)譜(pu)的(de)(de)變化(hua)。Arid1a缺(que)失(shi)(shi)后，有1266個(ge)上(shang)調基(ji)因和503個(ge)下調基(ji)因，如(ru)預期(qi)的(de)(de)那樣高度富(fu)(fu)集(ji)于(yu)OC分(fen)(fen)化(hua)。

為(wei)了了解(jie)與(yu)ARID1A相關(guan)(guan)的轉錄增(zeng)(zeng)強子(zi)(zi)，對RANKL誘導的破骨細(xi)胞進行(xing)了ChIP-seq測序，從而獲得ARID1A和(he)超級增(zeng)(zeng)強子(zi)(zi)SEs相關(guan)(guan)組(zu)蛋(dan)白修飾(shi)標記(ji)H3K27Ac的全基因組(zu)結合譜。確定(ding)了15039個增(zeng)(zeng)強子(zi)(zi)區域，其中783個SE區域在大小(xiao)和(he)H3K27Ac水平(ping)上與(yu)典型(xing)增(zeng)(zeng)強子(zi)(zi)不同。將(jiang)所有轉錄活性(xing)基因(TSSs)分配到50 kb窗口內的SEs上，鑒定(ding)出728個與(yu)SEs相關(guan)(guan)的基因，并提出NFATc1可能是調(diao)節破骨細(xi)胞終端分化(hua)的主開關(guan)(guan)。

單細胞(bao)測序內結果發(fa)現Nfatc1的(de)(de)表(biao)達在分(fen)化過(guo)(guo)程中上調，而(er)在Arid1a缺(que)失后的(de)(de)第4簇中沒有上調，這表(biao)明它可能是Arid1a在OC命運決(jue)定過(guo)(guo)程中的(de)(de)核心(xin)下游靶(ba)點。對EdU標記的(de)(de)增殖(zhi)細胞(bao)進行(xing)了12小時(shi)的(de)(de)追蹤，發(fa)現對照組(zu)中可以檢測到NFATc1+細胞(bao)，而(er)失去Arid1a后則很少。通過(guo)(guo)使用慢(man)病毒(du)載體(ti)在敲除小鼠的(de)(de)BMCs中組(zu)成(cheng)表(biao)達NFATc1。組(zu)成(cheng)性表(biao)達的(de)(de)Nfatc1部分(fen)挽救了ARID1A缺(que)失后的(de)(de)缺(que)陷OC分(fen)化，增加了MMP9、CTSK和ACP5的(de)(de)表(biao)達。表(biao)明ARID1A和超(chao)級增強子相互作用，調控Nfatc1基因功能，影響破骨細胞(bao)分(fen)化。（圖4）

BRD4作(zuo)為增(zeng)強子的表(biao)觀基(ji)因組解讀器，與介(jie)質相互作(zuo)用，并通過SE（超級增(zeng)強子）重(zhong)編程和TF（轉錄因子）重(zhong)連接活動參與轉錄延伸的控制。

引入BRD4后，首先進(jin)行BRD4抑(yi)制(zhi)實驗(yan)，發(fa)現BRD4受(shou)(shou)JQ1抑(yi)制(zhi)與ARID1A缺失(shi)之間的(de)(de)(de)(de)OC分化(hua)缺陷表(biao)型相(xiang)似(si)，TRAP+多核OC數量和(he)大小均減少，Mmp9、Ctsk、Acp5和(he)Dcstamp的(de)(de)(de)(de)表(biao)達均受(shou)(shou)到抑(yi)制(zhi)。為(wei)了(le)(le)進(jin)一步研究ARID1A和(he)BRD4在(zai)破(po)骨(gu)細(xi)(xi)胞(bao)形成過(guo)(guo)程(cheng)中的(de)(de)(de)(de)調控(kong)機制(zhi)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)似(si)性，我們(men)比較(jiao)了(le)(le)ARID1A和(he)BRD4 (RANKL誘導(dao)前(qian)后)的(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)合譜。結(jie)(jie)果顯示OC分化(hua)過(guo)(guo)程(cheng)只富集(ji)在(zai)ARID1A和(he)BRD4的(de)(de)(de)(de)共有基因(yin)上，提示它們(men)在(zai)破(po)骨(gu)細(xi)(xi)胞(bao)發(fa)生過(guo)(guo)程(cheng)中可(ke)能具(ju)有協同作用。考慮到ARID1A通過(guo)(guo)SE活(huo)性在(zai)OC細(xi)(xi)胞(bao)命運決(jue)定過(guo)(guo)程(cheng)中不可(ke)或缺的(de)(de)(de)(de)功能，以(yi)及(ji)JQ1抑(yi)制(zhi)BRD4和(he)RANKL誘導(dao)后ARID1A缺失(shi)導(dao)致Nfatc1轉(zhuan)錄抑(yi)制(zhi)，推測(ce)BRD4可(ke)能是激活(huo)Nfatc1 SE從而OC分化(hua)過(guo)(guo)程(cheng)中的(de)(de)(de)(de)關鍵共激活(huo)因(yin)子。雙免(mian)疫(yi)熒光染色也驗(yan)證了(le)(le)BRD4在(zai)ARID1A細(xi)(xi)胞(bao)核中的(de)(de)(de)(de)共定位在(zai)破(po)骨(gu)細(xi)(xi)胞(bao)發(fa)生中的(de)(de)(de)(de)作用。盡管(guan)(guan)BRD4的(de)(de)(de)(de)表(biao)達在(zai)mRNA和(he)蛋白質(zhi)水平上都(dou)不受(shou)(shou)影響，但(dan)在(zai)Arid1a缺失(shi)后，BRD4在(zai)Nfatc1 SE區域(yu)的(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)合受(shou)(shou)到損害，Arid1a與BRD4在(zai)Nfatc1 SE區域(yu)的(de)(de)(de)(de)共定位依賴(lai)于RANK信號傳導(dao)。表(biao)明(ming)BRD4與Nfatc1 SE位點(dian)的(de)(de)(de)(de)ARID1A協同保(bao)護破(po)骨(gu)細(xi)(xi)胞(bao)形成過(guo)(guo)程(cheng)中的(de)(de)(de)(de)管(guan)(guan)道化(hua)，ARID1A的(de)(de)(de)(de)缺失(shi)導(dao)致BRD4在(zai)Nfatc1位點(dian)的(de)(de)(de)(de)激活(huo)功能缺陷。

為(wei)了(le)確定在(zai)Nfatc1的(de)SE位(wei)(wei)點與(yu)ARID1A合(he)作(zuo)以(yi)保護破骨細胞(bao)形(xing)成過程(cheng)中(zhong)的(de)管道化的(de)關鍵譜系(xi)(xi)指定轉錄因子，我(wo)們對ARID1A和BRD4結(jie)合(he)譜進(jin)行了(le)基序分析(xi)。ChIP-Seq數(shu)據顯示ARID1A有(you)828個峰(feng)(p < 0.001)， ARID1A依(yi)(yi)賴性(xing)(xing)BRD4結(jie)合(he)有(you)1298個峰(feng)(p < 0.001)。Ets家族TF PU.1在(zai)ARID1A結(jie)合(he)位(wei)(wei)點的(de)頂部富集(ji)TF基序中(zhong)，以(yi)及在(zai)ARID1A耗盡后丟(diu)失的(de)ARID1A依(yi)(yi)賴性(xing)(xing)BRD4結(jie)合(he)位(wei)(wei)點中(zhong)。PU.1是造血過程(cheng)中(zhong)一種指定譜系(xi)(xi)的(de)TF，它(ta)正向調節許多共定位(wei)(wei)的(de)PU.1- brd4點，提(ti)示為(wei)ARID1A-BRD4-PU。除PU.1外，NFKB1、AP-1和NFATc1基序也在(zai)NFATc1 SE區富集(ji)，表明其也可能參與(yu)ARID1A/BRD4/PU。（圖5）

近期(qi)研究表(biao)明(ming)(ming)，BRD9-ncBAF復合物(wu)通過STAT1/IFN-β信號激活負向調節OC分(fen)化(hua)，這與本研究中證實(shi)的(de)(de)(de)(de)ARID1A的(de)(de)(de)(de)功能(neng)相反。我(wo)們(men)發(fa)現BRD9缺失(shi)BMC細(xi)胞中，ARID1A表(biao)達增強(qiang)，破(po)骨(gu)(gu)分(fen)化(hua)指(zhi)標MMP9增強(qiang)。使用siRNA敲(qiao)低ARID1A或者JQ1抑制BRD4的(de)(de)(de)(de)活性，可以逆轉BRD9缺失(shi)造成的(de)(de)(de)(de)破(po)骨(gu)(gu)分(fen)化(hua)過度(du)。表(biao)明(ming)(ming)ARID1A-BRD4復合物(wu)軸參與了BRD9缺失(shi)造成的(de)(de)(de)(de)破(po)骨(gu)(gu)增強(qiang)。雖然BRD9缺失(shi)后(hou)過度(du)激活的(de)(de)(de)(de)NFATc1被挽(wan)救，但在(zai)LysM-Cre的(de)(de)(de)(de)BMCs中，無(wu)論是siRNA敲(qiao)低ARID1A還是JQ1抑制BRD4，STAT1的(de)(de)(de)(de)表(biao)達仍(reng)然處于低水平(ping)，表(biao)明(ming)(ming)挽(wan)救機(ji)制不依賴于STAT1。此外ARID1A缺失(shi)導致BRD9蛋白(bai)水平(ping)升高。（圖(tu)6）

GSEA分(fen)析表(biao)明(ming)，與對照組相比，在RANKL誘導(dao)后(hou)，LysM-Cre;Arid1afl/fl小鼠BMCs中(zhong)IFN-β信號富集。qPCR驗證表(biao)明(ming)ARID1A缺失(shi)后(hou)，破(po)(po)骨細(xi)胞(bao)誘導(dao)的(de)BMCs中(zhong)Stat1和(he)(he)Ifnb1表(biao)達增加。表(biao)明(ming)BRD9/STAT1/IFN-β信號軸參(can)與ARID1A缺失(shi)導(dao)致(zhi)的(de)破(po)(po)骨細(xi)胞(bao)形成受損。在破(po)(po)骨細(xi)胞(bao)形成過程(cheng)中(zhong)使用BRD9抑制劑(ji)治療ARID1A缺失(shi)的(de)BMCs。發(fa)現BRD9抑制部分(fen)挽救了Arid1a缺失(shi)后(hou)OC分(fen)化缺陷，增加了TRAP+多核OC的(de)數(shu)量和(he)(he)大小以(yi)及(ji)Mmp9、Acp5、Dcstamp和(he)(he)Ctsk的(de)表(biao)達水平(ping)。（圖7）

進一步建立BRD9雜合敲(qiao)除(chu)LysM-Cre;Arid1afl/fl小鼠(shu)體內模型(xing)，驗證(zheng)這一假設。與3月齡雌性小鼠(shu)相比，LysM-Cre;Arid1afl/fl組的(de)骨質增生表型(xing)和(he)OC分化(hua)缺陷在LysM-Cre;Arid1afl/fl;BRD9fl/+組得到部(bu)分恢(hui)復，ARID1A缺失(shi)后(hou)STAT1異常上(shang)調得到緩解。

ARID1A缺(que)失(shi)導(dao)致(zhi)BRD9蛋(dan)(dan)白(bai)水(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)升(sheng)高，而mRNA水(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)無明顯(xian)變(bian)化(hua)，提(ti)示ARID1A缺(que)失(shi)后(hou)BRD9轉(zhuan)錄后(hou)水(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)調控可能發生了(le)變(bian)化(hua)。使用UbiBrowser 2.0軟件預(yu)測(ce)了(le)BRD9潛(qian)在(zai)的E3連(lian)接酶/DUBs。整合前15個預(yu)測(ce)的泛素(su)連(lian)接酶/DUBs，并比較對照組和LysM-Cre;Arid1afl/fl小鼠BMCs中(zhong)RNA-seq數據的差異表達分析。E3泛素(su)蛋(dan)(dan)白(bai)連(lian)接酶 MDM2在(zai)ARID1A缺(que)失(shi)后(hou)顯(xian)著下(xia)調。SP141抑制劑44降解MDM2可以(yi)增加BRD9蛋(dan)(dan)白(bai)水(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)，表明ARID1A缺(que)失(shi)后(hou)MDM2的下(xia)調可能有(you)助于BRD9蛋(dan)(dan)白(bai)水(shui)(shui)(shui)(shui)平(ping)的升(sheng)高。

因此，除了(le)通過(guo)在(zai)SE位點與共激活(huo)(huo)因子(zi)BRD4/譜系(xi)指定(ding)因子(zi)PU.1構建凝(ning)聚(ju)體激活(huo)(huo)OC主TF Nfatc1外，ARID1A與BRD9/Stat1軸(zhou)的(de)(de)拮(jie)抗(kang)功能(neng)對(dui)OC命運的(de)(de)決定(ding)也是至關重(zhong)要的(de)(de)。在(zai)增殖-分化轉換過(guo)程(cheng)中，ARID1A的(de)(de)缺(que)失(shi)導(dao)(dao)致Nfatc1上調和(he)(he)Stat1下調失(shi)敗。綜(zong)上所述，在(zai)OC譜系(xi)的(de)(de)分化傳(chuan)導(dao)(dao)過(guo)程(cheng)中，ARID1A-cBAF和(he)(he)BRD9-ncBAF復合物的(de)(de)功能(neng)相互拮(jie)抗(kang)，控制(zhi)和(he)(he)維護(hu)命運決定(ding)過(guo)程(cheng)。（圖8）

在BRD4抑制劑JQ1治療后(hou)，在ARID1A缺(que)失的BMCs中，STAT1的表達(da)水平(ping)下降，這表明(ming)(ming)ARID1A缺(que)失后(hou)BRD9- STAT1軸的增(zeng)強依賴(lai)于(yu)BRD4。BRD4通過與(yu)ARID1A-cBAF復合物的相互作(zuo)用(yong)激活破骨細(xi)胞的主要轉錄因子 Nfatc1，并通過與(yu)BRD9-ncBAF復合物的相互作(zuo)用(yong)增(zeng)強IFN-β信號轉導(dao)/Stat1活性(xing)。我們的發(fa)現表明(ming)(ming)ARID1A-“加速器(qi)”和(he)BRD9-“剎車”的拮(jie)抗作(zuo)用(yong)都依賴(lai)于(yu)BRD4, BRD4發(fa)揮(hui)“離合器(qi)”作(zuo)用(yong)。（圖9）

5、研究(jiu)結論(lun)