2024-10-11
近日，中國醫科大學附屬(shu)第(di)一醫院在《Emerging Microbes & Infections》期(qi)刊(kan)（最新影響(xiang)因子(zi)8.4）發表最新研究成(cheng)果(guo)！本研究收集了29株(zhu)(zhu)與棘(ji)(ji)白菌素(su)耐(nai)藥性(xing)增加相關的分(fen)離株(zhu)(zhu)，并通過抗真(zhen)菌藥物敏感性(xing)試驗和全基(ji)因組測序評(ping)估了棘(ji)(ji)白菌素(su)耐(nai)藥性(xing)的進化過程。這(zhe)項(xiang)研究為耳念珠菌棘(ji)(ji)白菌素(su)耐(nai)藥性(xing)的分(fen)子(zi)途(tu)徑(jing)提供了深入探索。 本研究的測序(xu)和分(fen)析由上海派森諾生物科技股(gu)份有限公司(si)完成。
研究背景 耳念珠菌(jun)（Candida auris）作為一(yi)種新興的(de)(de)(de)(de)(de)、多藥(yao)耐(nai)藥(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)真菌(jun)病(bing)原(yuan)(yuan)體(ti)，已被世(shi)界衛(wei)生(sheng)組織列為高(gao)度關(guan)注(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)優先(xian)病(bing)原(yuan)(yuan)體(ti)。其(qi)高(gao)耐(nai)藥(yao)性和(he)快(kuai)速傳(chuan)播能(neng)力給全(quan)球公共(gong)衛(wei)生(sheng)帶來了嚴峻挑戰。特別是棘白菌(jun)素(su)類(lei)藥(yao)物(wu)(wu)，作為治(zhi)療耳念珠菌(jun)感(gan)染的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)線(xian)藥(yao)物(wu)(wu)，其(qi)耐(nai)藥(yao)性的(de)(de)(de)(de)(de)出(chu)現更(geng)是引起了廣(guang)泛關(guan)注(zhu)(zhu)。然而，關(guan)于耳念珠菌(jun)如何逐步(bu)發展出(chu)對(dui)棘白菌(jun)素(su)類(lei)藥(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)耐(nai)藥(yao)性，特別是FKS1基(ji)(ji)因(yin)以(yi)外的(de)(de)(de)(de)(de)其(qi)他基(ji)(ji)因(yin)突變在耐(nai)藥(yao)過程中的(de)(de)(de)(de)(de)作用，仍知之甚少。本研究關(guan)注(zhu)(zhu)了在棘白菌(jun)素(su)治(zhi)療后出(chu)現耐(nai)藥(yao)性的(de)(de)(de)(de)(de)C. auris分離株(zhu)，探索了棘白菌(jun)素(su)暴(bao)露與藥(yao)物(wu)(wu)耐(nai)藥(yao)性出(chu)現之間的(de)(de)(de)(de)(de)潛在關(guan)聯，對(dui)C. auris分離株(zhu)進行了全(quan)基(ji)(ji)因(yin)組微進化特征分析。
研究材料與方法 1.實驗材料：中國(guo)沈陽地區臨(lin)床分離的29株耳(er)念珠菌(jun) 2.測序平臺：Illumina Novaseq 3.分析內容：藥敏試(shi)驗、真(zhen)菌重測序(xu)、系統(tong)發育(yu)分析、蛋白-蛋白互作網絡(luo)分析等
研究結果 臨(lin)床特(te)征和藥物(wu)敏感性(xing)分析 本研究共評估了29株(zhu)(zhu)菌(jun)，包括24株(zhu)(zhu)臨床分(fen)離(li)株(zhu)(zhu)。其中(zhong)(zhong)，7株(zhu)(zhu)ECN-R和(he)6株(zhu)(zhu)ECN-E菌(jun)株(zhu)(zhu)被鑒定出來。這些菌(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)，Y0021對氟康(kang)唑、兩(liang)性霉素B以及三種(zhong)(zhong)棘(ji)白(bai)菌(jun)素均耐藥(yao)。此(ci)外(wai)，在SICU8尿(niao)液標(biao)本分(fen)離(li)的(de)(de)菌(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)，棘(ji)白(bai)菌(jun)素MIC在治療后增加。C. auris A411菌(jun)株(zhu)(zhu)在治療前ANF、CAS和(he)MCF的(de)(de)MIC分(fen)別為0.25、0.5和(he)0.12 μg/mL；經過兩(liang)次治療后，A458（2022年(nian)(nian)6月(yue)27日(ri)）和(he)A466（2022年(nian)(nian)7月(yue)9日(ri)）分(fen)離(li)的(de)(de)菌(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)三種(zhong)(zhong)棘(ji)白(bai)菌(jun)素的(de)(de)MIC均為0.5和(he)8 μg/mL。然而，SICU8痰液分(fen)離(li)的(de)(de)菌(jun)株(zhu)(zhu)未表現出MIC升高。A427（2022年(nian)(nian)5月(yue)26日(ri)）分(fen)離(li)的(de)(de)菌(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)，ANF、CAS和(he)MCF的(de)(de)MIC分(fen)別為0.12、0.25和(he)0.25 μg/mL，而A459（2022年(nian)(nian)6月(yue)27日(ri)）分(fen)離(li)的(de)(de)菌(jun)株(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)每種(zhong)(zhong)藥(yao)物的(de)(de)MIC相同。 表(biao)1 29株耳念珠菌的(de)抗真菌藥敏數據 系統發育分析 將(jiang)本(ben)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)29個C. auris分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)與之前研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)(zhong)另外29個分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)結合在(zai)一(yi)(yi)起構建SNP系統(tong)發(fa)育樹(shu)。前研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)(zhong)獲得的(de)(de)(de)29個分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)有(you)25個聚集在(zai)亞(ya)(ya)群(qun)A，本(ben)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)(zhong)獲得的(de)(de)(de)29個分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)形成(cheng)了亞(ya)(ya)群(qun)B（包括B1、B2和B3子(zi)亞(ya)(ya)群(qun))。亞(ya)(ya)群(qun)B還包括前研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)四個分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)（RICU4 A7、RICU4 A8、RICU9 A52和C12A109），可能與本(ben)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)這29個分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)有(you)遺(yi)傳關(guan)系。此外，RICU40病(bing)例的(de)(de)(de)所有(you)分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)及(ji)其(qi)皮膚(fu)菌株(zhu)(zhu)(zhu)（Y0021、Y0024）、鄰近患(huan)者RICU37的(de)(de)(de)Y0006和Y0010分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)都(dou)位(wei)于(yu)B1子(zi)亞(ya)(ya)群(qun)，并且具有(you)緊密(mi)的(de)(de)(de)遺(yi)傳關(guan)聯。SICU5病(bing)例及(ji)其(qi)皮膚(fu)菌株(zhu)(zhu)(zhu)（Y0013）位(wei)于(yu)B2子(zi)亞(ya)(ya)群(qun)，而SICU8病(bing)例的(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)則(ze)位(wei)于(yu)B3子(zi)亞(ya)(ya)群(qun)。基于(yu)B1、B2和B3子(zi)亞(ya)(ya)群(qun)的(de)(de)(de)系統(tong)發(fa)育分(fen)(fen)(fen)析表明，同(tong)一(yi)(yi)病(bing)房和同(tong)一(yi)(yi)患(huan)者的(de)(de)(de)C. auris分(fen)(fen)(fen)離(li)株(zhu)(zhu)(zhu)之間最(zui)密(mi)切相關(guan)。 本(ben)研究中(zhong)(zhong)7株(zhu)ECN - R菌株(zhu)攜帶FKS1突變(bian)(即: A382和(he)A466為(wei)S639P , A430為(wei)S639Y , A441、A447、A451和(he)Y0021為(wei)S639F)。此外，9個(ge)(ge)(ge)ECN-R菌株(zhu)中(zhong)(zhong)有8個(ge)(ge)(ge)是(shi)從尿液標本(ben)中(zhong)(zhong)分離出(chu)來(lai)的(de)（其中(zhong)(zhong)兩個(ge)(ge)(ge)來(lai)自以前的(de)研究），另一(yi)個(ge)(ge)(ge)（Y0021）是(shi)從環境中(zhong)(zhong)分離出(chu)來(lai)的(de)。另外6個(ge)(ge)(ge)尿液分離物（A357、A359、A360、A367、A458和(he)A468）是(shi)ECN-E。 圖1 耳念珠菌臨床分離株的系統發育分析 全(quan)基因組SNP位點分析(xi) 對29株(zhu)耳(er)念珠菌進行WGS分(fen)析(xi)，共鑒定(ding)出(chu)47個(ge)(ge)(ge)突(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)基因。其中35個(ge)(ge)(ge)基因存在非同義突(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)，包括(kuo)30個(ge)(ge)(ge)單核苷(gan)酸多(duo)態性(xing)(xing)（SNPs）、5個(ge)(ge)(ge)多(duo)核苷(gan)酸多(duo)態性(xing)(xing)（MNPs），12個(ge)(ge)(ge)基因發生(sheng)(sheng)同義突(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)。在非同義突(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)基因中，IFF6在所有(you)菌株(zhu)中均發生(sheng)(sheng)突(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)，RBR3在大(da)多(duo)數(shu)菌株(zhu)中發生(sheng)(sheng)突(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)。來(lai)(lai)自(zi)RICU40和(he)RICU37的(de)分(fen)離株(zhu)有(you)7個(ge)(ge)(ge)共同的(de)突(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)基因，來(lai)(lai)自(zi)RICU40的(de)4個(ge)(ge)(ge)尿分(fen)離株(zhu)（A425、A441、A447和(he)A451）和(he)它的(de)腹股溝菌株(zhu)（Y0021）有(you)AMN1突(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)。對35個(ge)(ge)(ge)非同義突(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)基因進行了蛋白(bai)質相互(hu)作用(yong)分(fen)析(xi)，其中有(you)31個(ge)(ge)(ge)具有(you)相互(hu)作用(yong)。通過實(shi)驗確(que)(que)定(ding)了LRG1、MKC1和(he)GSC1/FKS1之(zhi)(zhi)間的(de)關聯(lian)性(xing)(xing)，并且還進行了文(wen)本(ben)(ben)挖掘和(he)共表達(da)分(fen)析(xi)，MYO1、IFF6、LRG1、MKC1和(he)GSC1/FKS1之(zhi)(zhi)間的(de)關聯(lian)性(xing)(xing)也通過實(shi)驗確(que)(que)定(ding)并進行文(wen)本(ben)(ben)挖掘，而FAA4和(he)FKS1之(zhi)(zhi)間的(de)關聯(lian)性(xing)(xing)僅通過共表達(da)確(que)(que)定(ding)。 圖2 非同義(yi)突變基因(yin)熱圖（A）和蛋白互作網絡分析（B） 特征基因的可(ke)追溯性分析 在四個病(bing)例的系(xi)列菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)，追蹤了已知功(gong)能非同(tong)義(yi)突(tu)(tu)變(bian)基因的譜(pu)系(xi)，并繪制(zhi)了這些基因的非同(tong)義(yi)突(tu)(tu)變(bian)圖譜(pu)。結(jie)果(guo)顯(xian)示FKS1、ALR2、SLD1、UTP22和MRPL10突(tu)(tu)變(bian)僅發生在ECN-R菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)；而MET15、MPH1、CDR1、UPC2和IRA2突(tu)(tu)變(bian)僅出(chu)現在ECN-E菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)；RBR3、IFF6、YOR1、THR4、PRO41、RAD2、ECM22、PWP2、MYO1、LRG1、PIN3、MKC1、FAA4、SCH9、NSP1和AMN1突(tu)(tu)變(bian)同(tong)時存在于ECN-S和ECN-R菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)(zhong)。IFF6和RBR3在幾乎所有的早期分離株(zhu)(zhu)(zhu)（MIC = 0.12μg/mL）中(zhong)(zhong)都發生了突(tu)(tu)變(bian)。FKS1突(tu)(tu)變(bian)的7株(zhu)(zhu)(zhu)菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)，SICU8 A466、RICU40 A441、RICU40 A447、RICU40 A451、RICU40 A430、RICU38 A382和Y0021均對MCF耐藥（MIC = 8μg/mL）。 圖(tu)3 從(cong)病例分(fen)離到MCF MIC到非同義突變SNPS基因的桑基圖(tu)
結論 本研究通過綜合應用抗(kang)真菌(jun)(jun)(jun)藥(yao)物(wu)(wu)敏感性(xing)測試(shi)和基因(yin)組測序技(ji)術，深入探(tan)討(tao)了耳念(nian)珠(zhu)菌(jun)(jun)(jun)對棘白(bai)菌(jun)(jun)(jun)素類藥(yao)物(wu)(wu)耐(nai)(nai)藥(yao)性(xing)的進(jin)化(hua)機制，揭示(shi)了FKS1基因(yin)突變在耐(nai)(nai)藥(yao)過程中的核心(xin)作用。同時，研究還發現了其他基因(yin)在耐(nai)(nai)藥(yao)進(jin)化(hua)中的潛在貢獻，為理解耳念(nian)珠(zhu)菌(jun)(jun)(jun)耐(nai)(nai)藥(yao)性(xing)的復雜性(xing)和多樣性(xing)提供(gong)了新(xin)的視角。這些發現不僅有(you)助于我們(men)更好地認識耳念(nian)珠(zhu)菌(jun)(jun)(jun)的耐(nai)(nai)藥(yao)機制，還為開(kai)發新(xin)的抗(kang)真菌(jun)(jun)(jun)藥(yao)物(wu)(wu)和治療(liao)策略提供(gong)了重要的理論(lun)依據。
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