2024-11-01
文章(zhang)題目
Microenvironment-responsive metal-phenolic network release platform with ROS scavenging, anti-pyroptosis, and ECM regeneration for intervertebral disc degeneration
技(ji)術手段(duan)
RNA-seq、SEM、免疫(yi)熒光、qPCR、Western Blot等
中(zhong)南大學(xue)湘(xiang)雅(ya)三(san)醫院在(zai)國際權威學(xue)術(shu)期(qi)刊《Bioactive Materials》發表(biao)(biao)了關具(ju)有(you)(you)ROS清(qing)除、抗(kang)焦亡和ECM再生(sheng)的微(wei)環(huan)境響(xiang)應型(xing)金屬酚(fen)網絡釋放平臺(tai)用于椎(zhui)間(jian)盤退(tui)變治療(liao)研(yan)究的相關文章，在(zai)IVDD大鼠模型(xing)中(zhong)，TMP@Alg-PBA/PVA通(tong)過(guo)減緩疾病進展表(biao)(biao)現出優異的治療(liao)效(xiao)果，解釋了該(gai)平臺(tai)具(ju)有(you)(you)治療(liao)IVDD的臨床潛(qian)力。本研(yan)究中(zhong)轉(zhuan)錄組測序(xu)及部(bu)分分析均由上海派森諾生(sheng)物科技股份有(you)(you)限公司完成。
01、研究(jiu)背景
椎間盤退變(IVDD)可(ke)由衰老、損傷和(he)遺傳因素(su)引起。與IVDD相關(guan)的病(bing)理變化包括活(huo)性氧(ROS)的過度積(ji)累、細(xi)胞焦(jiao)亡(wang)和(he)細(xi)胞外基質(ECM)降解(jie)。盡(jin)管目前臨(lin)床(chuang)上有很多新技術用來(lai)治療和(he)緩解(jie)IVDD帶來(lai)的癥狀，但是這(zhe)些方法(fa)都是治標不治本。該研究提供了TMP@Alg-PBA/PVA通過按需釋放NPs清除(chu)ROS、抑制(zhi)細(xi)胞焦(jiao)亡(wang)和(he)減少ECM降解(jie)來(lai)協同治療IVDD的臨(lin)床(chuang)潛力的證據。
02、技術路線
03、研究內容
1.IVDD組織(zhi)標本病理變化的觀察
我(wo)們研究了椎間(jian)盤退(tui)(tui)變(bian)（IVDD）的病理變(bian)化(hua)(hua)，發(fa)現隨著(zhu)退(tui)(tui)變(bian)進(jin)展(zhan)，髓核組(zu)織(zhi)(zhi)脫水(shui)加(jia)劇，T2加(jia)權MRI信(xin)號減弱(ruo)，椎間(jian)隙(xi)變(bian)窄(zhai)或消失(shi)(shi)。紅O-快綠染(ran)色和HE染(ran)色顯(xian)示細胞數量減少(shao)、ECM紊(wen)亂及(ji)纖維化(hua)(hua)增(zeng)加(jia)。免疫組(zu)化(hua)(hua)和半定量分析(xi)表明，高Pfirrmann分級的退(tui)(tui)變(bian)IVD組(zu)織(zhi)(zhi)中(zhong)II型膠原和聚集蛋白表達(da)顯(xian)著(zhu)降(jiang)低，提示水(shui)分喪(sang)失(shi)(shi)和纖維化(hua)(hua)病變(bian)。焦(jiao)亡相關蛋白NLRP3炎性(xing)小(xiao)體、caspase-1和IL-1β在(zai)V級和IV級退(tui)(tui)變(bian)組(zu)織(zhi)(zhi)中(zhong)表達(da)較高，而(er)在(zai)III級中(zhong)最低，表明焦(jiao)亡促進(jin)IVDD進(jin)展(zhan)。活(huo)性(xing)氧（ROS）與焦(jiao)亡和ECM降(jiang)解密切相關，在(zai)IVDD發(fa)展(zhan)中(zhong)起重要作用(yong)，清除(chu)ROS對治療IVDD至關重要。
圖1 臨床退(tui)行(xing)性IVD標本的病理改變
2.TMP NPs的表征
通過Mn2?與(yu)單寧酸(suan)（TA）自組(zu)裝，構建了TA-Mn（TM）配合的(de)金(jin)屬(shu)(shu)多酚網絡，并用PVP修飾TM表面(mian)，得到(dao)穩定的(de)TMP NPs溶(rong)液(ye)。FTIR驗證(zheng)了合成(cheng)結果(guo)，熱重分析顯示TMP NPs中(zhong)有機組(zu)分含量(liang)超(chao)過73.2%，表明高(gao)藥(yao)物(wu)負載。全掃描(miao)光譜證(zheng)實TMP NPs主要由碳、氧(yang)、氮和錳(meng)組(zu)成(cheng)。合成(cheng)的(de)TMP金(jin)屬(shu)(shu)多酚網絡具有低Mn2?濃度(du)，降低了潛在(zai)的(de)金(jin)屬(shu)(shu)毒性。研究表明，Mn2?釋放(fang)可加速(su)膠原循環和ECM重塑(su)。綜上，TMP合成(cheng)具有低毒性、高(gao)載藥(yao)量(liang)、在(zai)多種(zhong)溶(rong)液(ye)環境下穩定且藥(yao)物(wu)降解慢。
圖2 TMP NPs的合成與表征
3.TMP NPs清除ROS的活(huo)性
研(yan)究了TMP NPs的(de)ROS清(qing)除(chu)(chu)能(neng)力，使(shi)用ABTS和(he)DPPH探針檢測發現，100 μg/mL TMP NPs可(ke)清(qing)除(chu)(chu)超過70%的(de)自(zi)由基，表明(ming)其具有(you)濃度依賴性(xing)的(de)自(zi)由基清(qing)除(chu)(chu)能(neng)力。?OH和(he)O2??清(qing)除(chu)(chu)實驗(yan)也證(zheng)實TMP NPs能(neng)降(jiang)低這(zhe)些(xie)自(zi)由基。細胞實驗(yan)顯示，隨著TMP NPs濃度增加，ROS逐步被(bei)清(qing)除(chu)(chu)，進一步證(zheng)實了其強ROS清(qing)除(chu)(chu)能(neng)力。JC-1實驗(yan)表明(ming)，NPs還(huan)能(neng)提高線(xian)粒體活(huo)性(xing)。圖3 TMP NPs清(qing)除(chu)(chu)ROS的(de)活(huo)性(xing)
圖3 TMP NPs清除ROS的活(huo)性
4.TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠(jiao)釋放(fang)平臺的(de)表征
為防(fang)止注射(she)到IVD內(nei)的溶(rong)液流向周圍關鍵區(qu)(qu)域，設計(ji)了一種微(wei)環境響應釋(shi)放平臺，以(yi)在(zai)(zai)退(tui)化區(qu)(qu)域局部釋(shi)放NPs，并在(zai)(zai)健(jian)康組(zu)織中保持(chi)穩定，實(shi)現(xian)按需和(he)有(you)(you)效的藥物遞(di)送(song)。我(wo)們將TMP與PVA混合形成TMP@PVA，加(jia)(jia)入(ru)(ru)Alg-PBA快速成凝膠。掃描(miao)電(dian)鏡和(he)能(neng)譜分(fen)析(xi)證實(shi)了TMP NPs的成功負載和(he)均勻分(fen)布(bu)。自愈合實(shi)驗(yan)顯示水(shui)(shui)凝膠可在(zai)(zai)15分(fen)鐘內(nei)重(zhong)新連接(jie)。降解試驗(yan)表明，水(shui)(shui)凝膠對ROS刺激(ji)有(you)(you)響應，加(jia)(jia)入(ru)(ru)H2O2后(hou)NPs累積(ji)釋(shi)放量顯著增加(jia)(jia)。總之，該釋(shi)放平臺有(you)(you)望用于IVD注射(she)。
圖4 TMP@Alg-PBA/PVA水凝膠釋放平臺的(de)表征
5.TMP NPs的細胞攝取、溶酶(mei)體逃逸(yi)和線粒體積累(lei)
納米顆粒(li)（NPs）的(de)細胞攝(she)(she)取(qu)(qu)效(xiao)(xiao)率對治(zhi)療效(xiao)(xiao)果至關(guan)重要。我(wo)們將CY5熒光(guang)標(biao)記的(de)TMP NPs加(jia)載到水(shui)凝膠中，發現隨著(zhu)NPs濃度增(zeng)(zeng)加(jia)，細胞攝(she)(she)取(qu)(qu)逐(zhu)漸增(zeng)(zeng)加(jia)，但超過200 μg/mL后不再顯(xian)著(zhu)增(zeng)(zeng)加(jia)。共培養時(shi)間(jian)越長(chang)，細胞內的(de)熒光(guang)強度也逐(zhu)漸增(zeng)(zeng)加(jia)，流式(shi)細胞儀結果一致(zhi)。TMP NPs在NPCs中表(biao)現出快速攝(she)(she)取(qu)(qu)和長(chang)時(shi)間(jian)保留，適合(he)即時(shi)細胞治(zhi)療和長(chang)期保護。Mito-tracker熒光(guang)標(biao)記顯(xian)示NPs與線粒(li)體有顯(xian)著(zhu)正相關(guan)關(guan)系。總(zong)之，NPs被細胞吸收(shou)后通過溶酶(mei)體逃逸釋放到胞漿中，靶向線粒(li)體，促進TMP更有效(xiao)(xiao)地清(qing)除ROS。
圖5 TMP NPs的細胞(bao)攝取(qu)、溶酶體逃逸和線粒(li)體積累
6.TMP@Alg-PBA/PVA水凝(ning)膠釋放平(ping)臺對體外焦亡的影響
我們假設TMP@Alg-PBA/PVA可以抑制(zhi)細(xi)(xi)胞焦(jiao)亡，并(bing)進行了研究。使(shi)用40 ng/mL IL-1β誘導(dao)NPCs焦(jiao)亡，CCK-8實(shi)驗顯(xian)示(shi)(shi)TMP@Alg-PBA/PVA組(zu)(zu)的細(xi)(xi)胞活力顯(xian)著(zhu)高于對照組(zu)(zu)和Gel組(zu)(zu)。IL-1β處(chu)(chu)理后，凋亡相關蛋(dan)白表達(da)(da)增(zeng)(zeng)加，而TMP@Alg-PBA/PVA處(chu)(chu)理后無(wu)顯(xian)著(zhu)變(bian)化(hua)。LDH檢(jian)測顯(xian)示(shi)(shi)，TMP@Alg-PBA/PVA組(zu)(zu)的LDH水平(ping)降低，表明細(xi)(xi)胞膜破裂(lie)減少。SEM觀察顯(xian)示(shi)(shi)，IL-1β組(zu)(zu)細(xi)(xi)胞膜孔洞增(zeng)(zeng)多，而治療(liao)(liao)組(zu)(zu)細(xi)(xi)胞形態(tai)保(bao)持完整。RT-qPCR、免疫熒(ying)光(guang)和Western blot分析顯(xian)示(shi)(shi)，治療(liao)(liao)組(zu)(zu)中IL-1β、TNF-α及NLRP3、caspase-1、GSDMD-N的表達(da)(da)顯(xian)著(zhu)降低。綜上所(suo)述，TMP@Alg-PBA/PVA有(you)效抑制(zhi)細(xi)(xi)胞焦(jiao)亡。
圖6 TMP@Alg-PBA/PVA對焦亡的影響
7.TMP@Alg-PBA/PVA抑制焦亡的(de)潛在機制
盡管已驗(yan)證(zheng)TMP@Alg-PBA/PVA水(shui)(shui)凝膠(jiao)具有抗焦亡(wang)特(te)性，但具體機制(zhi)(zhi)(zhi)尚(shang)不(bu)清楚。通(tong)(tong)(tong)過高(gao)通(tong)(tong)(tong)量mRNA測(ce)序，我們發現兩組間有2967個(ge)差(cha)異表達(da)基因（DEGs），其(qi)中(zhong)(zhong)1472個(ge)上調(diao)，1495個(ge)下(xia)(xia)調(diao)。GO分(fen)析(xi)顯(xian)示(shi)(shi)這(zhe)些(xie)DEGs主(zhu)要與(yu)發育、細(xi)胞(bao)反應(ying)(ying)、分(fen)化(hua)和ECM相(xiang)關。KEGG通(tong)(tong)(tong)路(lu)富集(ji)分(fen)析(xi)顯(xian)示(shi)(shi)，TNF信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)(hao)通(tong)(tong)(tong)路(lu)、IL-17信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)(hao)通(tong)(tong)(tong)路(lu)、細(xi)胞(bao)周期和Toll樣(yang)受(shou)體信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)(hao)通(tong)(tong)(tong)路(lu)在治療組中(zhong)(zhong)被(bei)下(xia)(xia)調(diao)，特(te)別是IL-17信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)(hao)通(tong)(tong)(tong)路(lu)顯(xian)著抑(yi)制(zhi)(zhi)(zhi)。Western Blot分(fen)析(xi)顯(xian)示(shi)(shi)，添加IL-17抑(yi)制(zhi)(zhi)(zhi)劑后，IL-17/ERK信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)(hao)通(tong)(tong)(tong)路(lu)及其(qi)下(xia)(xia)游焦亡(wang)相(xiang)關蛋(dan)白的(de)表達(da)減(jian)弱。本研究首次(ci)揭示(shi)(shi)了IL-17/ERK信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)(hao)通(tong)(tong)(tong)路(lu)在IVDD中(zhong)(zhong)促進焦亡(wang)的(de)作(zuo)用。在IL-1β處理的(de)NPCs中(zhong)(zhong)，IL-17A、MEK、pMEK等蛋(dan)白水(shui)(shui)平升(sheng)高(gao)，而添加抑(yi)制(zhi)(zhi)(zhi)劑和TMP@Alg-PBA/PVA后，這(zhe)些(xie)效應(ying)(ying)被(bei)逆轉，焦亡(wang)減(jian)少(shao)。綜上所(suo)述，TMP@Alg-PBA/PVA可能通(tong)(tong)(tong)過抑(yi)制(zhi)(zhi)(zhi)NPCs中(zhong)(zhong)的(de)IL-17/ERK信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)(hao)通(tong)(tong)(tong)路(lu)來減(jian)少(shao)細(xi)胞(bao)焦亡(wang)，為(wei)IVDD治療提供(gong)了新的(de)潛在靶點。
圖7轉錄組測(ce)序及分析
8.TMP@Alg-PBA/PVA治療后ECM的變化
IVDD的(de)(de)主要特征是(shi)水(shui)分子丟失、ECM降解(jie)、纖維化(hua)增加(jia)及椎間盤機械損傷。減(jian)少ROS積累和(he)細胞焦亡可減(jian)輕ECM降解(jie)，TMP@Alg-PBA/PVA平臺釋放的(de)(de)Mn2+可能為NPCs提供局(ju)部Mn2+環(huan)境，加(jia)速膠原蛋(dan)白(bai)循環(huan)，促進(jin)ECM重塑。我們利用IL-1β刺激NPCs模擬炎癥環(huan)境對ECM的(de)(de)影響。結果顯示(shi)，IL-1β處(chu)理后，聚集蛋(dan)白(bai)和(he)Col-II的(de)(de)熒光強度顯著降低，表(biao)明IL-1β嚴(yan)重損害(hai)了(le)NPCs重塑ECM的(de)(de)能力。RT-qPCR和(he)WB實驗顯示(shi)，TMP@Alg-PBA/PVA處(chu)理有效(xiao)降低了(le)ECM降解(jie)酶（如MMP-3和(he)MMP-13）的(de)(de)表(biao)達(da)，并恢(hui)復了(le)聚集蛋(dan)白(bai)和(he)Col-II的(de)(de)表(biao)達(da)。這些結果表(biao)明，TMP@Alg-PBA/PVA平臺能有效(xiao)抵消IL-1β對ECM的(de)(de)有害(hai)影響，顯示(shi)出在IVD修復和(he)再生中的(de)(de)潛力。
圖8 炎癥環境中TMP@Alg-PBA/PVA對(dui)ECM的影響
9.TMP@Alg-PBA/PVA對il -1β誘導的(de)大鼠IVDD模型的(de)影響
為了評估TMP@Alg-PBA/PVA在(zai)(zai)體內(nei)的(de)(de)療效，我們(men)通過IL-1β誘導大(da)鼠(shu)IVDD，并在(zai)(zai)注(zhu)射(she)后3天進(jin)行干預。我們(men)在(zai)(zai)IVDD大(da)鼠(shu)體內(nei)原位注(zhu)射(she)10 μL的(de)(de)TMP@Alg-PBA/PVA釋放平(ping)臺(tai)(tai)。4周和(he)(he)8周后，影像學分析顯示(shi)，PBS組(zu)和(he)(he)Gel組(zu)的(de)(de)DHI顯著(zhu)下降且骨贅形成增(zeng)加，表明這兩(liang)種處理未能(neng)有(you)效減(jian)輕(qing)IVDD。然(ran)而，添加含有(you)200 μg/mL TMP NPs的(de)(de)高劑量組(zu)和(he)(he)100 μg/mL TMP NPs的(de)(de)低(di)劑量組(zu)后，DHI下降速(su)度減(jian)緩。高劑量組(zu)的(de)(de)效果優于低(di)劑量組(zu)，表明該平(ping)臺(tai)(tai)對IVDD有(you)顯著(zhu)療效。MRI顯示(shi)，高劑量組(zu)的(de)(de)髓核含水量增(zeng)加，進(jin)一步(bu)證(zheng)實(shi)了TMP@Alg-PBA/PVA在(zai)(zai)治療IVDD中的(de)(de)關鍵作用。
圖9 動物(wu)實(shi)驗的影像(xiang)學(xue)評價
10.組(zu)織染(ran)色和免疫組(zu)織化學
我們對IVDD大鼠尾部(bu)退變組(zu)(zu)(zu)織進行切片(pian)和(he)染色(se)。HE染色(se)顯(xian)(xian)示，PBS組(zu)(zu)(zu)和(he)Gel組(zu)(zu)(zu)出(chu)現(xian)顯(xian)(xian)著(zhu)的組(zu)(zu)(zu)織結構喪(sang)失、髓(sui)核萎(wei)縮及纖維(wei)化(hua)，而高劑(ji)量(liang)和(he)低劑(ji)量(liang)TMP@Alg-PBA/PVA組(zu)(zu)(zu)保(bao)持(chi)了(le)清晰的組(zu)(zu)(zu)織邊(bian)界和(he)軟骨(gu)終(zhong)板形態。番紅O-快綠染色(se)顯(xian)(xian)示，PBS組(zu)(zu)(zu)和(he)Gel組(zu)(zu)(zu)髓(sui)核減少并伴有纖維(wei)化(hua)，而TMP@Alg-PBA/PVA組(zu)(zu)(zu)維(wei)持(chi)了(le)纖維(wei)環(huan)和(he)髓(sui)核的邊(bian)界。免疫組(zu)(zu)(zu)化(hua)結果顯(xian)(xian)示，TMP@Alg-PBA/PVA組(zu)(zu)(zu)中Col-II和(he)聚集蛋白表達顯(xian)(xian)著(zhu)增加(jia)，表明該平臺有效減輕ECM降解并維(wei)持(chi)IVD含(han)水(shui)量(liang)。
圖10 IVDD大鼠尾巴的組織學和免(mian)疫組織化學分(fen)析
11.TMP@Alg-PBA/PVA在(zai)體內治療IVDD的作用機制
為了評(ping)估TMP@Alg-PBA/PVA通過減輕細胞(bao)焦亡(wang)緩解IVDD的潛力，我(wo)們對IVD髓核組(zu)織進行了免疫(yi)熒(ying)光(guang)染色(se)。Caspase-1用紅色(se)標(biao)記(ji)，GSDMD用綠(lv)色(se)標(biao)記(ji)。假手術(shu)組(zu)和高劑(ji)量(liang)組(zu)中這兩種蛋白幾乎不(bu)表(biao)(biao)達，而低劑(ji)量(liang)組(zu)略有增(zeng)加(jia)，Gel組(zu)和PBS組(zu)則顯著增(zeng)強，表(biao)(biao)明(ming)焦亡(wang)加(jia)劇(ju)。熒(ying)光(guang)半定量(liang)分析顯示(shi)，高劑(ji)量(liang)組(zu)由(you)于(yu)TMP負載量(liang)高，抗焦亡(wang)效果更(geng)佳。這些結果表(biao)(biao)明(ming)，TMP@Alg-PBA/PVA平臺可通過減輕細胞(bao)焦亡(wang)減緩IVDD進展。
圖(tu)11 TMP拯救大(da)鼠IVDD的分子機制(zhi)
04、結 論
在本(ben)研(yan)究(jiu)中，我們開發(fa)了多(duo)功能(neng)且微環境響應的(de)金屬酚網(wang)絡釋放(fang)平(ping)(ping)臺(tai)（TMP@Alg-PBA/PVA），裝載的(de)TMP納(na)米(mi)顆粒(li)(li)可(ke)按需(xu)釋放(fang)以清除ROS。體外和體內研(yan)究(jiu)表(biao)明，該平(ping)(ping)臺(tai)能(neng)有效靶向線粒(li)(li)體、減少細胞焦亡、抑制ECM降解(jie)，并增加IVD含水量。該平(ping)(ping)臺(tai)通過(guo)抑制IL-17/ERK信號通路，為IVDD治(zhi)(zhi)療提供(gong)了一種優秀的(de)抑制焦亡的(de)方法。盡管已有類似平(ping)(ping)臺(tai)報道(dao)，但TMP@Alg-PBA/PVA具有按需(xu)釋放(fang)和多(duo)方面(mian)作(zuo)用的(de)優勢(shi)，顯示出治(zhi)(zhi)療IVDD的(de)潛力，值得進(jin)一步臨(lin)床(chuang)前(qian)研(yan)究(jiu)。
原文索引：//doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.02.036
