期(qi)刊：Developmental Cell

影響因子：10.7

研究背景(jing)

PTEN 是人類癌癥中最常見的腫瘤抑制因子之一，其功能的缺失與多種癌癥的發生、發展以及對免疫治療的耐藥性密切相關。然而，已有研究主要集中在 PTEN 的細胞內功能，對其在腫瘤微環境（TME）中的免疫調節作用了解有限。特別是，PTEN 缺失的腫瘤通常表現出免疫抑制微環境，增加了腫瘤對免疫療法的抵抗力。近年來，研究表明 PTEN 可以通過一種非傳統的蛋白質分泌途徑分泌到細胞外，然而其在腫瘤免疫中的具體機制尚未明確。2024年8月27日，上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院/海南醫科大學陳(chen)國強院(yuan)士(shi)團隊在Developmental Cell上發表了文章Secreted PTEN binds PLXDC2 on macrophages to drive antitumor immunity and tumor suppression，揭示了PTEN可通過非經典蛋白分泌通路THU以可溶形式分泌到細胞外，并通過重編程腫瘤免疫微環境，實現抗腫瘤免疫的激活與腫瘤抑制。派森諾(nuo)生(sheng)物為該研究(jiu)提(ti)供了單細胞(bao)轉錄組(zu)測序服(fu)務。

結 果

01 、PTEN 通過 TMED10 通道(dao)蛋白分泌途徑分泌

作(zuo)者在多種細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系的(de)(de)培養上清液中(zhong)(zhong)都(dou)發現(xian)了(le)(le)PTEN蛋(dan)白(bai)及其他已知的(de)(de)分(fen)泌蛋(dan)白(bai)，如HMGB1 和Gal-1。而(er)293T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)上清液中(zhong)(zhong)缺少GM130，這排除了(le)(le)上清液中(zhong)(zhong)的(de)(de)PTEN蛋(dan)白(bai)來自(zi)死細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)可能性。另(ling)一方面(mian)，從PTEN 敲(qiao)除的(de)(de)小鼠(shu)胚胎成纖維細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和PTEN缺陷的(de)(de)U251膠質母細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)瘤細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)上清液中(zhong)(zhong)未檢測到PTEN，進(jin)一步(bu)證(zheng)明(ming) PTEN來自(zi)活細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。ELISA試驗表明(ming)，293T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在1小時內(nei)分(fen)泌了(le)(le)450 pg PTEN ，而(er)通過CRISPR-Cas9 系統敲(qiao)除 PTEN 則消除了(le)(le)該分(fen)泌。這些結(jie)果表明(ming)，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內(nei)的(de)(de) PTEN 蛋(dan)白(bai)可被分(fen)泌到細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)外。

考慮到有報道稱 PTEN 是通過(guo)外(wai)泌(mi)(mi)體(ti)分(fen)泌(mi)(mi)的，作(zuo)者還探討(tao)了(le)外(wai)泌(mi)(mi)體(ti)介導(dao) PTEN 分(fen)泌(mi)(mi)的可能(neng)性(xing)。為此，作(zuo)者收集了(le)與293T細胞孵育(yu)1小時和24小時的培(pei)養基，通過(guo)超濾分(fen)離(li)和TEM分(fen)析，發(fa)現(xian)外(wai)泌(mi)(mi)體(ti)中PTEN的含量有限，證(zheng)明外(wai)泌(mi)(mi)體(ti)不是 PTEN 分(fen)泌(mi)(mi)的主要途(tu)徑。

然(ran)后(hou)作者(zhe)進(jin)一步排除了(le) PTEN 通過常(chang)規蛋(dan)白質分(fen)泌途徑分(fen)泌的(de)可(ke)能性，因為(wei)布雷(lei)菲德菌(jun)素 A 可(ke)阻斷分(fen)泌蛋(dan)白從內質網(wang)到高(gao)爾基體的(de)運輸(shu)，但(dan)對(dui)293T 細胞(bao)分(fen)泌內源(yuan)性 PTEN 沒(mei)有影響。這與(yu)使用(yong) SignalP 預(yu)測的(de) PTEN 蛋(dan)白缺(que)乏典(dian)型分(fen)泌信(xin)號的(de)事實一致。為(wei)了(le)找到 PTEN 分(fen)泌途徑的(de)線索，作者(zhe)轉(zhuan)向 PTEN 相互(hu)作用(yong)蛋(dan)白，發現PTEN與(yu)HSP90B1、TMED10和HSP90AB1相互(hu)作用(yong)，這些是(shi)THU通路的(de)組成部分(fen)。敲除 TMED10發現可(ke)顯著降低分(fen)泌的(de) PTEN 量，而(er)過表達 TMED10 可(ke)進(jin)一步增加(jia)分(fen)泌的(de) PTEN 量。此外，HSP90AB1 或 HSP90B1 的(de)耗(hao)竭(jie)會抑制 PTEN 的(de)分(fen)泌，而(er)它們的(de)共同(tong)耗(hao)竭(jie)則顯示出最強的(de)效果(guo)。這些結果(guo)表明 THU 可(ke)能是(shi) PTEN 分(fen)泌的(de)主要途徑。

為(wei)了鞏固(gu) PTEN 通過(guo) THU 分(fen)(fen)(fen)泌的(de)(de)觀(guan)點，作者(zhe)(zhe)發現PTEN與TMED10共定(ding)位在(zai)(zai)ERGIC上(shang)，并與TMED10中(zhong)(zhong)的(de)(de)類似區(qu)域結合，如同(tong)IL-1b。通過(guo)MEME-Suite網站分(fen)(fen)(fen)析，作者(zhe)(zhe)發現PTEN和IL-1b有共同(tong)基序，其(qi)中(zhong)(zhong)基序3對PTEN分(fen)(fen)(fen)泌至(zhi)關重要。W274是(shi)指(zhi)導THU分(fen)(fen)(fen)泌PTEN的(de)(de)關鍵氨基酸殘基，W274突變幾乎消除了PTEN與TMED10的(de)(de)相互作用。PTEN的(de)(de)W274在(zai)(zai)物種中(zhong)(zhong)高(gao)度保(bao)守。綜上(shang)，TMED10通過(guo)識別PTEN的(de)(de)W274來指(zhi)導其(qi)通過(guo)THU通路。

02、細(xi)胞外可溶(rong)性 PTEN 抑(yi)制腫瘤生長和(he)免(mian)疫反應(ying)

2.1 細胞外(wai)可溶性 PTEN 抑制腫瘤生長(chang)

作者(zhe)用ELISA試驗檢測B16-F10小(xiao)鼠黑色素瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)胞腫瘤(liu)間質液（TIF）中(zhong)(zhong)的(de)PTEN蛋白(bai)，發(fa)現(xian)PTEN以22 ng / mL的(de)濃度(du)存在于TIF中(zhong)(zhong)，這驗證了(le)TME中(zhong)(zhong)細(xi)(xi)(xi)胞外PTEN的(de)存在。而后(hou)為(wei)了(le)確定TIF中(zhong)(zhong)PTEN的(de)來源(yuan)，比較親本(ben)B16-F10細(xi)(xi)(xi)胞和PTEN敲(qiao)除的(de)B16-F10細(xi)(xi)(xi)胞系產生的(de)TIF，發(fa)現(xian)后(hou)者(zhe)中(zhong)(zhong)PTEN減少了(le)約80%，說明腫瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)胞是TME中(zhong)(zhong)分泌PTEN的(de)主要來源(yuan)。

為了評估分泌(mi)型 PTEN 在 TME 中的(de)作用，將(jiang) PTEN 敲除的(de) MC38 細(xi)胞(bao) (MC38-DPTEN)進(jin)行(xing)野生型 PTEN (PTEN-WT) 或含有(you) W274L 突變的(de) PTEN 突變體 (PTEN-W274L)再表達，發(fa)現PTEN-W274L 的(de)分泌(mi)效率低于 PTEN-WT，但(dan)它們對 AKT 磷酸(suan)化 (Ser473) 的(de)抑制強度相似(si) ，這(zhe)表明 W274L 突變選擇性地(di)影(ying)響 PTEN 的(de)分泌(mi)，但(dan)不影(ying)響其磷酸(suan)酶活性。然后，將(jiang)這(zhe)些細(xi)胞(bao)系在 C57BL/6J 小鼠中進(jin)行(xing)皮下生長，結(jie)果顯示與 PTEN-WT 相比，PTEN W274L 的(de)腫(zhong)瘤抑制作用受損 ，這(zhe)表明分泌(mi)型 PTEN 可(ke)能(neng)在腫(zhong)瘤抑制中發(fa)揮作用

為了進(jin)一步評估分(fen)泌型 PTEN 在腫(zhong)瘤(liu)抑制中的(de)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)，作(zuo)(zuo)者嘗試直接(jie)用(yong)(yong) PTEN 蛋白治療(liao)腫(zhong)瘤(liu)。

與所有對(dui)照(zhao)組相(xiang)比，PTEN 蛋(dan)白治療表現出顯著的劑量依賴性(xing)(xing)(xing)腫瘤(liu)抑制(zhi)作(zuo)用(yong)。細胞外(wai) PTEN 的腫瘤(liu)抑制(zhi)作(zuo)用(yong)也(ye)(ye)可以在 MC38-DPTEN 細胞產生(sheng)的腫瘤(liu)中重(zhong)現。值得注意的是，純(chun)化(hua)的 PTEN 蛋(dan)白攜帶(dai)一種使其磷(lin)酸酶(mei)活(huo)性(xing)(xing)(xing)失活(huo)的突變（PTEN-C124S），其對(dui)腫瘤(liu)生(sheng)長的抑制(zhi)程度與 PTEN-WT 相(xiang)似。此外(wai)，腹膜內(nei)注射純(chun)化(hua)的 PTEN 也(ye)(ye)顯著抑制(zhi)了(le)B16-F10-DPTEN 腫瘤(liu)的生(sheng)長。總(zong)之，細胞外(wai)可溶性(xing)(xing)(xing)PTEN以磷(lin)酸酶(mei)活(huo)性(xing)(xing)(xing)非依賴的方式發揮腫瘤(liu)抑制(zhi)作(zuo)用(yong)。

2.2 細胞(bao)外 PTEN 引發抗腫瘤免疫反應

與體內(nei)抑瘤(liu)作(zuo)用(yong)相反，細(xi)胞(bao)(bao)外(wai) PTEN 治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)不影響 B16-F10DPTEN 細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)體外(wai)生(sheng)長，這暗示它可能作(zuo)用(yong)于TME。事實(shi)上，當通(tong)過(guo) RNA 測(ce)序分析(xi) PTEN 治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)的(de)(de) B16-F10-DPTEN 腫(zhong)瘤(liu)時，對(dui) 104 個(ge)失調基因的(de)(de) GO 分析(xi)顯示，它們主要富集在(zai)參與免疫(yi)反應(ying)的(de)(de)途徑中。特(te)別是(shi)，干擾(rao)素(su) a 和 IFNg 反應(ying)的(de)(de)強(qiang)烈激活表(biao)明(ming) PTEN 治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)會在(zai)腫(zhong)瘤(liu)中引發抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)免疫(yi)反應(ying)。此外(wai)，作(zuo)者對(dui) PTEN 治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)和未(wei)(wei)治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)的(de)(de) B16-F10DPTEN 腫(zhong)瘤(liu)進行單細(xi)胞(bao)(bao) RNA 轉錄(lu)組(zu)測(ce)序 (scRNA-seq)。結果顯示，與轉錄(lu)組(zu)幾乎未(wei)(wei)受干擾(rao)的(de)(de)癌細(xi)胞(bao)(bao)相比(bi)，免疫(yi)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)轉錄(lu)組(zu)發生(sheng)了(le)顯著變化，表(biao)明(ming) PTEN 治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)優(you)先改變了(le) TIME。

接著，作(zuo)者使用質譜流(liu)式細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)術對接受 PTEN 治(zhi)療和(he)未(wei)接受 PTEN 治(zhi)療的(de)(de)(de)(de)(de) B16-F10-DPTEN 腫(zhong)瘤(liu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)(yi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)進行了(le)分(fen)析。中(zhong)性粒細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)總(zong)數變(bian)化(hua)(hua)最為顯著，巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)總(zong)數略有改變(bian)，而 CD4+ /CD8+ T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he) NK 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)總(zong)數未(wei)受到(dao)影(ying)(ying)響(xiang)。然而，在(zai)接受 PTEN 治(zhi)療的(de)(de)(de)(de)(de)腫(zhong)瘤(liu)中(zhong)，表(biao)(biao)達活(huo)化(hua)(hua)標志物 CD69 的(de)(de)(de)(de)(de) CD8+ T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he) NK 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)比例顯著增(zeng)(zeng)加。通過對 B16-F10DPTEN 腫(zhong)瘤(liu)以及 MC38-DPTEN 腫(zhong)瘤(liu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de) IFNg 陽性 CD8+ T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)顆粒酶(mei) A (GZMA) 陽性 NK 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)進行流(liu)式細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)術分(fen)析，進一步證實了(le) PTEN-WT 或(huo) PTEN-C124S 治(zhi)療增(zeng)(zeng)強了(le) CD8+ T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)NK細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)活(huo)化(hua)(hua)。與此同時(shi)，MC38-DPTEN 腫(zhong)瘤(liu)中(zhong) PTEN 分(fen)泌的(de)(de)(de)(de)(de)喪失導致了(le)免疫(yi)(yi)(yi)抑制表(biao)(biao)型。結(jie)果表(biao)(biao)明，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)外(wai) PTEN 可增(zeng)(zeng)強抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)免疫(yi)(yi)(yi)力。此外(wai)，當(dang)用 PTEN 治(zhi)療在(zai)免疫(yi)(yi)(yi)缺(que)陷 NCG 小鼠(shu)中(zhong)生長(chang)的(de)(de)(de)(de)(de) B16-F10-DPTEN 腫(zhong)瘤(liu)時(shi)，未(wei)觀察到(dao)對腫(zhong)瘤(liu)生長(chang)的(de)(de)(de)(de)(de)明顯影(ying)(ying)響(xiang)，這表(biao)(biao)明細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)外(wai) PTEN 以免疫(yi)(yi)(yi)反應(ying)依(yi)賴的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)式抑制腫(zhong)瘤(liu)生長(chang)

由于之前已(yi)證實(shi) PTEN 無(wu)法在沒有(you)(you)遞送劑的(de)(de)幫(bang)助下進入細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，作者推(tui)測(ce)它(ta)是否與(yu) TME 中(zhong)的(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)表(biao)面結合。作者從 PTEN 治(zhi)療(liao)的(de)(de) B16F10-DPTEN 腫(zhong)瘤(liu)中(zhong)分離(li)出上(shang)述(shu) PTEN 調(diao)節的(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（巨噬(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、中(zhong)性(xing)粒細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、T 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和 NK 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)），并測(ce)試了(le) PTEN 在其表(biao)面的(de)(de)存(cun)在。在四種類型的(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)，只有(you)(you)巨噬(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)被 PTEN 標(biao)記(ji)。通(tong)過將 PTEN 蛋白與(yu)從 C57BL/6J 小(xiao)鼠脾臟中(zhong)分離(li)的(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)進行(xing)體外孵育(yu)，可(ke)以(yi)確認 PTEN 在巨噬(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)結合中(zhong)的(de)(de)偏(pian)好。此外，PTEN 以(yi)劑量依賴性(xing)方式與(yu)從骨(gu)髓來源的(de)(de)巨噬(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（BMDM）和腹腔中(zhong)分離(li)的(de)(de)巨噬(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)結合。將 FLAG 標(biao)記(ji)的(de)(de) PTEN 與(yu)未通(tong)透的(de)(de) BMDM 一起孵育(yu)后，通(tong)過對 PTEN 進行(xing)免(mian)(mian)疫(yi)熒光染色，也可(ke)以(yi)觀察(cha)到 PTEN 在 BMDM 表(biao)面上(shang)的(de)(de)存(cun)在，而未觀察(cha)到細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內(nei)信號。所有(you)(you)這(zhe)些結果都表(biao)明(ming) PTEN 與(yu)巨噬(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)表(biao)面結合。

03、細(xi)胞外 PTEN 使(shi)巨(ju)噬細(xi)胞極化(hua)為 M1 樣(yang)表型

雖然 PTEN 治療廣泛(fan)改變了 BMDM 的轉錄組，但(dan)基因集(ji)富集(ji)分析 (GSEA) 表明，前(qian)三個上調通路都(dou)與脂(zhi)多(duo)糖 (LPS) 刺激的信(xin)號(hao)傳(chuan)導有關(guan)。

LPS 是一(yi)種(zhong)常規刺激物(wu)，可(ke)誘(you)導 BMDM 的促(cu)炎(yan)（M1 樣(yang)）極化(hua)(hua)， 這促(cu)使作者推(tui)測PTEN可(ke)能誘(you)導BMDM發(fa)生(sheng)M1樣(yang)極化(hua)(hua)。而GSEA和M1標志物(wu)表達的增加支持了這一(yi)觀(guan)點。這些結果表明，細胞外 PTEN 治(zhi)療使BMDM 極化(hua)(hua)為(wei) M1 樣(yang)表型。

TME中的巨噬細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)被(bei)稱(cheng)為腫瘤相(xiang)關(guan)巨噬細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao) (TAM)，它(ta)們(men)與免疫抑制性 M2 極(ji)化巨噬細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)非(fei)常相(xiang)似。為了(le)研(yan)(yan)究(jiu)PTEN對TAM的影響，研(yan)(yan)究(jiu)者先用IL-4和IL-13處理BMDM誘導(dao)M2樣極(ji)化。PTEN治(zhi)療增加了(le)M1標(biao)志物(wu)(wu)的表(biao)達，降低了(le)M2標(biao)志物(wu)(wu)的表(biao)達，并(bing)顯(xian)著提高(gao)了(le)IL-1b與CD206的表(biao)達比。這些結(jie)果(guo)表(biao)明(ming)，PTEN能將M2樣巨噬細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉化為M1樣表(biao)型。

先前CyTOF數(shu)(shu)(shu)據顯示 PTEN 治(zhi)療(liao)(liao)的(de)(de)(de)(de)(de)腫瘤(liu)(liu)(liu)具有明(ming)顯較少的(de)(de)(de)(de)(de) M2 樣(yang)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)，卻有更多的(de)(de)(de)(de)(de) M1 樣(yang)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)。另外，作者利用scRNA-seq 數(shu)(shu)(shu)據在TAM中(zhong)計算了(le)單細(xi)胞(bao)水平上基于 M1 和 M2 基因(yin)特(te)征(zheng)(zheng)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)數(shu)(shu)(shu)，PTEN治(zhi)療(liao)(liao)的(de)(de)(de)(de)(de)腫瘤(liu)(liu)(liu)中(zhong)分(fen)(fen)離(li)的(de)(de)(de)(de)(de)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)顯示出明(ming)顯更高的(de)(de)(de)(de)(de) M1 基因(yin)特(te)征(zheng)(zheng)分(fen)(fen)數(shu)(shu)(shu)，且M2基因(yin)特(te)征(zheng)(zheng)分(fen)(fen)數(shu)(shu)(shu)低得多。RNA測(ce)序數(shu)(shu)(shu)據的(de)(de)(de)(de)(de)GSEA分(fen)(fen)析也顯示PTEN處理(li)的(de)(de)(de)(de)(de)腫瘤(liu)(liu)(liu)發生了(le)從M2到M1的(de)(de)(de)(de)(de)轉化。流(liu)式細(xi)胞(bao)術(shu)分(fen)(fen)析表(biao)(biao)明(ming)PTEN治(zhi)療(liao)(liao)增(zeng)加了(le)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)中(zhong)IL-1b與(yu)CD206的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)比率(lv)，且這種作用不依賴于PTEN的(de)(de)(de)(de)(de)磷酸(suan)酶活性。PTEN-WT在腫瘤(liu)(liu)(liu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)重新表(biao)(biao)達(da)(da)(da)增(zeng)加了(le)IL-1b與(yu)CD206的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)比率(lv)，而PTEN-W274L的(de)(de)(de)(de)(de)重新表(biao)(biao)達(da)(da)(da)則顯示出大部(bu)分(fen)(fen)受損(sun)的(de)(de)(de)(de)(de)作用。這些(xie)結果表(biao)(biao)明(ming)PTEN治(zhi)療(liao)(liao)使(shi)TAM極化偏向M1樣(yang)表(biao)(biao)型。

04、PTEN 依賴(lai)巨(ju)噬細胞增強抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長(chang)

作(zuo)(zuo)(zuo)者發(fa)現在(zai)缺乏PTEN的(de)腫瘤中(zhong)(zhong)不再觀察到(dao)PTEN治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)的(de)抑癌(ai)作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)，同時也不再促進(jin)CD8+ T和(he)NK細(xi)(xi)胞(bao)的(de)活化(hua)(hua)。此(ci)外，巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)耗盡(jin)消除了(le)PTEN 治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)在(zai)促進(jin) CD8+T和(he)NK細(xi)(xi)胞(bao)活化(hua)(hua)方面(mian)的(de)作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)，這(zhe)表(biao)明 TAM 是介導PTEN治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)激(ji)活 CD8+T和(he)NK細(xi)(xi)胞(bao)所必需(xu)的(de)。這(zhe)一(yi)觀點在(zai)體(ti)外得(de)到(dao)了(le)進(jin)一(yi)步(bu)(bu)證實。所有這(zhe)些結(jie)果表(biao)明巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)極化(hua)(hua)是PTEN治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)下CD8+T和(he) NK細(xi)(xi)胞(bao)激(ji)活的(de)上游事件(jian)，它們的(de)順序(xu)發(fa)生介導細(xi)(xi)胞(bao)外PTEN的(de)腫瘤抑制作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)。作(zuo)(zuo)(zuo)者通過CellChat軟(ruan)件(jian)分析scRNA-seq數據，發(fa)現SPP1-CD44軸在(zai)TAM抑制T細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)起關(guan)鍵作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)，并且PTEN處理顯(xian)著影響TAM和(he)T細(xi)(xi)胞(bao)之間的(de)相互作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)。盡(jin)管PTEN治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)增(zeng)加了(le)中(zhong)(zhong)性(xing)粒細(xi)(xi)胞(bao)的(de)數量，但它們對于PTEN介導的(de)腫瘤抑制并非必需(xu)。中(zhong)(zhong)性(xing)粒細(xi)(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)加與巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)極化(hua)(hua)無直接(jie)關(guan)聯。因此(ci)，PTEN治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)后(hou)中(zhong)(zhong)性(xing)粒細(xi)(xi)胞(bao)增(zeng)加的(de)機制和(he)作(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)需(xu)要進(jin)一(yi)步(bu)(bu)研究。

05、PTEN 與巨噬細胞上的 PLXDC2 結(jie)合發揮抗(kang)腫瘤作(zuo)用

由于PTEN未進(jin)入巨噬(shi)(shi)細胞(bao)表(biao)面，而(er)是優先(xian)與(yu)(yu)其結合，因此作者推測巨噬(shi)(shi)細胞(bao)存在特異(yi)性PTEN受體。為了識別該受體，作者通(tong)過數據庫篩選(xuan)出了PLXDC2。PLXDC2 特異(yi)性地表(biao)達(da)在巨噬(shi)(shi)細胞(bao)的表(biao)面，但不表(biao)達(da)在中性粒細胞(bao)、T細胞(bao)或(huo)NK細胞(bao)的表(biao)面，敲低PLXDC2在很大(da)程(cheng)度上(shang)阻止(zhi)了 PTEN 與(yu)(yu)M2極(ji)化的BMDM結合。

最后，作者發現PTEN在體外(wai)直接與(yu)(yu)PLXDC2的(de)細胞(bao)外(wai)結(jie)構域 (ECD) 相互(hu)作用(yong)，但(dan)不與(yu)(yu)細胞(bao)內結(jie)構域 (ICD) 相互(hu)作用(yong)，并且不與(yu)(yu)細胞(bao)中缺(que)乏ECD的(de)PLXDC2相互(hu)作用(yong)。將(jiang)過度純化的(de)PLXDC2-ECD 添加(jia)到培(pei)養基(ji)中會(hui)消除PTEN與(yu)(yu)M2極(ji)化的(de)BMDM表(biao)面的(de)結(jie)合。這些結(jie)果都表(biao)明 PLXDC2 是(shi)一種介導 PTEN 與(yu)(yu)巨噬細胞(bao)表(biao)面結(jie)合的(de) PTEN 受體。

體(ti)外(wai)實驗(yan)顯(xian)(xian)(xian)示(shi)PTEN直接與(yu)PLXDC2的(de)(de)(de)細胞(bao)外(wai)結構域相互作(zuo)用(yong)。PLXDC2敲(qiao)低顯(xian)(xian)(xian)著改變(bian)了PTEN處(chu)理(li)下(xia)M2極化BMDM的(de)(de)(de)轉錄組，逆轉了PTEN處(chu)理(li)導致的(de)(de)(de)基因變(bian)化。PLXDC2缺(que)陷的(de)(de)(de)BMDMs無(wu)法介(jie)導體(ti)外(wai)PTEN激活CD8+T和NK細胞(bao)的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)。使用(yong)PLXDC2敲(qiao)低的(de)(de)(de)巨(ju)噬(shi)細胞(bao)與(yu)B16-F10DPTEN細胞(bao)共(gong)植(zhi)入小鼠，發現PTEN的(de)(de)(de)腫(zhong)瘤抑制(zhi)作(zuo)用(yong)在(zai)PLXDC2敲(qiao)低組中顯(xian)(xian)(xian)著減弱。骨髓特異性PLXDC2耗盡小鼠實驗(yan)也顯(xian)(xian)(xian)示(shi)，PTEN處(chu)理(li)對這些小鼠產生的(de)(de)(de)腫(zhong)瘤無(wu)抑制(zhi)效果(guo)。這些結果(guo)表(biao)明，細胞(bao)外(wai) PTEN 依賴(lai)于其與(yu)巨(ju)噬(shi)細胞(bao)表(biao)面的(de)(de)(de) PLXDC2 相互作(zuo)用(yong)來(lai)激活抗腫(zhong)瘤免疫并抑制(zhi)腫(zhong)瘤生長。

06、PTEN-PLXDC2 參(can)與激活 JAK2-STAT1 信號以重新編程巨噬細胞

PLXDC2的(de)(de)下游信號傳導在很大程度(du)上是(shi)未知的(de)(de)。作(zuo)(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)發(fa)現在所有(you)已確(que)定與(yu)PLXDC2-ICD相互作(zuo)(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)的(de)(de)蛋(dan)白(bai)質中(zhong)，Janus 激酶 2 (JAK2) 表(biao)現出最(zui)強的(de)(de)強度(du)。作(zuo)(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)驗(yan)證了PLXDC2-ICD與(yu) BMDM中(zhong)的(de)(de) JAK2而非其他家族成員的(de)(de)選擇性(xing)結(jie)合以及全(quan)長(chang)PLXDC2與(yu)293T細胞(bao)中(zhong)異位表(biao)達的(de)(de)JAK2之(zhi)間(jian)的(de)(de)相互作(zuo)(zuo)(zuo)(zuo)用(yong)。

試驗(yan)(yan)驗(yan)(yan)證了PLXDC2-ICD與JAK2的(de)選擇性(xing)結合，并且PTEN處理增加了M2極化(hua)巨(ju)噬細(xi)胞中(zhong)JAK2的(de)磷酸化(hua)，這(zhe)一過程依賴于PLXDC2。使用JAK2特異性(xing)抑制劑發(fa)現(xian)，它們能(neng)阻(zu)斷PTEN在(zai)巨(ju)噬細(xi)胞極化(hua)中(zhong)的(de)作用，表(biao)明PLXDC2通過PTEN激活JAK2來調節巨(ju)噬細(xi)胞極化(hua)。

TEN處理以PLXDC2和(he)JAK2依(yi)賴的(de)(de)(de)方式特異性地增(zeng)加了 STAT1 (Tyr701) 的(de)(de)(de)磷酸化，但未(wei)增(zeng)加其(qi)他 STAT的(de)(de)(de)磷酸化，表明PTEN PLXDC2-JAK2軸(zhou)激活了STAT1。STAT1在巨噬(shi)細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)M1極化中(zhong)起著(zhu)既定的(de)(de)(de)作用。事(shi)實上(shang)，STAT1 抑制表現出與PLXDC2 敲低(di)類似(si)的(de)(de)(de)效果，可拮抗(kang)細胞(bao)(bao)外PTEN對(dui)巨噬(shi)細胞(bao)(bao)重編程的(de)(de)(de)影(ying)響。總的(de)(de)(de)來說，作者確(que)定了JAK2-STAT1信(xin)號傳導負責介導巨噬(shi)細胞(bao)(bao)中(zhong)PTEN-PLXDC2的(de)(de)(de)下游信(xin)號傳導。

07、細胞外PTEN與PD-1阻斷協同作用以(yi)抑制腫瘤生長(chang)

研究表明，M2 樣TAM對各種治(zhi)療(liao)劑產(chan)生耐藥(yao)性，如PD-1阻斷。因此，作者測試了(le) PTEN 誘導的(de)(de)促腫瘤(liu)發(fa)生M2樣TAM 重編程為抗(kang)腫瘤(liu) M1 樣表型是否會導致對免(mian)疫(yi)檢查(cha)點阻斷的(de)(de)反應增(zeng)強。單用(yong)PTEN 或(huo) PD-1 阻斷抗(kang)體治(zhi)療(liao)都可縮小 B16-F10-DPTEN 腫瘤(liu)的(de)(de)大(da)小，而聯合 PTEN/抗(kang) PD-1 治(zhi)療(liao)顯示出(chu)最顯著的(de)(de)效果。

PD-1阻斷(duan)不影響細胞外PTEN水平或TAM上(shang)PLXDC2表(biao)達，表(biao)明其作(zuo)用(yong)獨立于PTEN-PLXDC2軸。在CT26結直腸(chang)癌和Lewis肺癌模型中(zhong)，PD-1阻斷(duan)對(dui)腫(zhong)瘤(liu)負(fu)荷無影響，但PTEN治療(liao)(liao)顯示出中(zhong)等(deng)抗腫(zhong)瘤(liu)作(zuo)用(yong)，聯(lian)合治療(liao)(liao)則顯著減小了腫(zhong)瘤(liu)大(da)小。總體而言，PTEN治療(liao)(liao)增強(qiang)了體內(nei)抗PD-1治療(liao)(liao)的效(xiao)果。

為了解 PLXDC2在 TAM 中(zhong)的(de)臨床意義，作者創建了兩個基因特(te)征來(lai)代表 PLXDC2 + 和(he) PLXDC2 TAM，并將(jiang)它們(men)應用于TCGA 數據庫中(zhong)的(de)大(da)量 RNA-seq 數據集(ji)，使用 CIBERSORTx 工(gong)具來(lai)確(que)定每個樣本(ben)中(zhong) PLXDC2 + 和(he) PLXDC2 TAM 的(de)比例(li)(li)。分(fen)析顯示，PLXDC2 + TAM 比例(li)(li)較(jiao)高的(de)患者總生存率較(jiao)低。在TCGA 數據庫的(de)COAD、ESCA 和(he) LIHC 患者中(zhong)也觀察到類似結果(guo)。這些發現與骨髓特(te)異(yi)性 Plxdc2耗盡小鼠腫瘤生長延遲的(de)結果(guo)一致。

從(cong)結(jie)腸(chang)直腸(chang)癌患(huan)(huan)(huan)者(zhe)的(de)(de)腫瘤(liu)組(zu)(zu)織中分(fen)離(li)出腫瘤(liu)浸潤性(xing)TAM，并確認(ren)其表(biao)達(da) PLXDC2。作(zuo)者(zhe)發現，所(suo)有患(huan)(huan)(huan)者(zhe)的(de)(de) TAM 在接受 PTEN 治(zhi)療后，CD86 與 CD206 的(de)(de)表(biao)達(da)比率均(jun)增加(jia)，表(biao)明 PTEN 誘導(dao)患(huan)(huan)(huan)者(zhe)來源的(de)(de) TAM 的(de)(de) M2 極化至 M1 極化。作(zuo)者(zhe)還從(cong)每(mei)位患(huan)(huan)(huan)者(zhe)的(de)(de)外周血中分(fen)離(li)出 CD8+ T 和NK 細(xi)胞(bao)，并使用(yong)來自一名患(huan)(huan)(huan)者(zhe)的(de)(de)樣(yang)本示例性(xing)地(di)證實了自體 TAM 抑制了這些細(xi)胞(bao)。然(ran)后，每(mei)個(ge)患(huan)(huan)(huan)者(zhe)的(de)(de)TAM經PTEN處理后與自體CD8+ T和NK細(xi)胞(bao)孵育。結(jie)果表(biao)明，與 PTEN 處理的(de)(de) TAM 一起(qi)孵育的(de)(de) CD8+ T 和 NK 細(xi)胞(bao)比與未用(yong) PTEN 處理的(de)(de) TAM 一起(qi)培養的(de)(de) CD8+ T 和 NK 細(xi)胞(bao)表(biao)現出更(geng)高的(de)(de)活(huo)性(xing)，表(biao)明 PTEN 在減輕患(huan)(huan)(huan)者(zhe)來源的(de)(de) TAM 的(de)(de)免疫抑制作(zuo)用(yong)方(fang)面發揮作(zuo)用(yong)。因此，體外數據表(biao)明，患(huan)(huan)(huan)者(zhe)活(huo)組(zu)(zu)織檢查的(de)(de)TAM對PTEN治(zhi)療有反應。

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