2024-11-15
期刊：ADVANCED SCIENCE
通(tong)訊作(zuo)者：張莎莎、柴人杰
單位：東南大學
影響因子：IF14.3
研究方向(xiang)：內耳(er)毛細胞(bao)再生與保(bao)護；耳(er)聾基因致聾機制
一、研究背景
小細胞外囊泡（sEVs）是細胞間通訊的重要介質。與體外來源的sEVs相比，組織來源的sEVs可以更準確地反映特定組織釋放的體內信號。目前，有關sEVs在耳蝸中的作用的研究主要依賴于體外來源的sEVs。因此，東南大學張莎莎、柴人杰作為共同通訊作者，2024年11月5日在Advanced Science 發表了題為“Isolation and Comprehensive Analysis of Cochlear Tissue-Derived Small Extracellular Vesicles”的研究論文。研究應用小RNA測序、蛋白質組學分析耳蝸組織來源sEV（CDsEV）的miRNA和蛋白質，并且應用單個CDsEV測序和單細胞RNA測序數據的聯合分析來追蹤CDsEVs的細胞來源。其中單CDsEV-RNA測(ce)序和部分數(shu)據分析由上海派森諾完成(cheng)。
Highlight：
①該研究評估了三種耳蝸組織消(xiao)化方法(fa)和CDsEV分(fen)離(li)(li)方法(fa)，首(shou)次提出了使用膠原酶D和DNase ?結(jie)合蔗糖密度梯度離(li)(li)心分(fen)離(li)(li)CDsEVs的最佳方法(fa)。
②該(gai)研究全面研究了CDsEVs的(de)(de)內容。發現CDsEVs的(de)(de)miRNA和蛋白(bai)質對(dui)于維持正常的(de)(de)聽覺功(gong)能至關重(zhong)要，CDsEVs中的(de)(de)FGFR1可能通過sEVs介導耳蝸毛細胞(bao)的(de)(de)存活(huo)。
③該研究全面研究了CDsEVs細胞來源。通過單外泌體RNA測序(xu)發(fa)現不(bu)同(tong)類型的(de)耳蝸細胞分(fen)泌的(de)CDsEVs數量不(bu)同(tong)，其中K?lliker器細胞和支持細胞分(fen)泌最多。
小細(xi)(xi)胞(bao)外囊泡(pao)（sEVs）的(de)直徑在30–200 nm，可被(bei)幾(ji)乎所有類型的(de)細(xi)(xi)胞(bao)分泌到(dao)體液（例如血(xue)液、尿(niao)液、唾液、淚(lei)液和腦脊液）和間質中(zhong)，對sEVs及其內容物的(de)研究對于闡明細(xi)(xi)胞(bao)間通訊機制(zhi)和增強臨床(chuang)診斷和治療具有重(zhong)要意(yi)義。過(guo)去幾(ji)年，組織來源(yuan)的(de) sEV（TDsEV）已成為生物醫學研究的(de)重(zhong)點。然而(er)，因為在TDsEV分離(li)過(guo)程中(zhong)會被(bei)破裂細(xi)(xi)胞(bao)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)囊泡(pao)污(wu)染，TDsEVs的(de)分離(li)和檢(jian)測仍然具有挑戰性(xing)。
傳統分(fen)離技(ji)術超速離心、超濾法、共聚沉淀、免疫磁珠等都會引入更復雜的成分(fen)，而傳統的檢測(ce)方法例(li)如TEM，NTA，WB又(you)缺乏外(wai)泌體的細(xi)胞來源信息（2021，姚波）。本研究提(ti)供了針對CDsEVs的分(fen)離方法，結合多組學，包(bao)括單個細(xi)胞層(ceng)面(mian)的高通量檢測(ce)的思路，為增強對耳(er)蝸中(zhong)CDsEVs的認識(shi)提(ti)供了很(hen)好的參(can)考(kao)。
二、研(yan)究(jiu)思路
三(san)、研究結果
1.三(san)種耳蝸組織消化(hua)方法和CDsEV分離方法評估
考慮到即使是最溫和的研磨也不能完全避免細胞內容物的污染，導致提取的CDsEV存在雜質，阻礙了進一步的功能研究，需要建立最優的酶切方法，最大限度地避免細胞損傷，并將CDsEV釋放到組織細胞間隙。本研究評估了膠原酶D聯合DNase Ι、單獨使用膠原酶III和單獨使用木瓜蛋白酶的消化效果，以確定消化新生小鼠耳蝸組(zu)織的最佳酶。隨后采用UC、蔗糖密度梯度超離心（SDGU）和SEC分離CDsEV，并通過對比分析最終選定以3u膠原酶D和40u dna酶Ι消化耳蝸后，SDGU分離CDsEV（圖1-圖3）。
圖1：CDsEV分離(li)、檢(jian)測流程圖
2.小(xiao)RNA測(ce)序分(fen)析耳蝸(gua)組織來源(yuan)sEV（CDsEV）的miRNA和(he)蛋白質
通(tong)(tong)過(guo)小RNA測(ce)序(xu)分(fen)析了耳蝸(gua)樣本(ben)和(he)CDsEV兩個樣本(ben)。共檢測(ce)到550個miRNA，其(qi)中(zhong)(zhong)兩組均有399個（圖(tu)4A、B），僅在CDsEV或耳蝸(gua)組織中(zhong)(zhong)存在的miRNA分(fen)別(bie)有73個和(he)78個（圖(tu)4C）。GO通(tong)(tong)路(lu)富集分(fen)析發現(xian)sEV主要(yao)來源于核(he)(he)內(nei)體、早(zao)期核(he)(he)內(nei)體和(he)晚(wan)期核(he)(he)內(nei)體，參與(yu)神經(jing)系統發育(yu)、囊泡介(jie)導的運輸、早(zao)期核(he)(he)內(nei)體到晚(wan)期核(he)(he)內(nei)體的運輸，參與(yu)多(duo)種重要(yao)細胞功能與(yu)信(xin)號通(tong)(tong)路(lu)（圖(tu)4G-H）。此外，KEGG分(fen)析發現(xian)65個CDsEV衍生(sheng)的miRNA的靶基因(yin)參與(yu)多(duo)種聽覺(jue)活動信(xin)號通(tong)(tong)路(lu)（圖(tu)4I）。這(zhe)些結果表明，CDsEV中(zhong)(zhong)的miRNA可能在聽覺(jue)個體發生(sheng)和(he)成熟(shu)過(guo)程中(zhong)(zhong)起調節作用。
圖(tu)4.CDsEV的小RNA測序(xu)分析
3.蛋白(bai)質組學探索(suo)CDsEV的蛋白(bai)質組成和生物學功能(neng)
以(yi)等量(liang)的(de)(de)耳蝸(gua)組織蛋(dan)(dan)白為對(dui)(dui)照，對(dui)(dui)CDsEV進行(xing)了無標記的(de)(de)定(ding)量(liang)蛋(dan)(dan)白質組學分析。每組包(bao)括3個(ge)生(sheng)(sheng)物重(zhong)復，樣品(pin)間相關性良(liang)好(hao)（圖(tu)5A）。兩組共鑒定(ding)出4739個(ge)蛋(dan)(dan)白，其中CDsEV鑒定(ding)出3040個(ge)蛋(dan)(dan)白，耳蝸(gua)組織鑒定(ding)出4301個(ge)蛋(dan)(dan)白（圖(tu)5B）。通路富集分析（圖(tu)5F-H）表明CDsEV中的(de)(de)蛋(dan)(dan)白在(zai)聽力發育過程中積極參與耳蝸(gua)形成、HC成熟和(he)突(tu)觸連接形成的(de)(de)生(sheng)(sheng)物學過程，對(dui)(dui)聽覺系統的(de)(de)建(jian)立和(he)聲(sheng)音感知具有重(zhong)要意義。
圖(tu)5.CDsEV的小RN蛋(dan)白質(zhi)組(zu)學分析
4.CDsEV FGFR1的表(biao)達和作用
通過WB、OC和(he)SGN (圖6A-C)的免疫熒(ying)光染色檢(jian)測(ce)P3小鼠耳蝸BM、M和(he)SL中FGFR1的表達。發現FGFR1表達受(shou)損會影響HC的存活(huo)和(he)細胞凋亡(wang)。
圖(tu)6.CDsEV中(zhong)FGFR1的表達和作用(yong)
5.單sEV-seq數(shu)(shu)據(ju)與(yu)耳蝸scRNA-seq數(shu)(shu)據(ju)的聯(lian)合(he)分析追(zhui)蹤(zong)CDsEV的細(xi)胞(bao)起源
利用10x Genomics測(ce)(ce)序平臺對CDsEV進行了單(dan)EV測(ce)(ce)序分(fen)析。通(tong)過CB2算法(fa)處理后(hou)，可(ke)以明(ming)顯區分(fen)比細胞小的CDsEV（圖(tu)(tu)7A）。之后(hou)，共檢測(ce)(ce)到536個(ge)符合條件的sEV（圖(tu)(tu)7B）。降(jiang)維聚類為8個(ge)細胞群(qun)（圖(tu)(tu)7C）。
為了追蹤CDsEV的細胞起源，進一步(bu)將單個CDsEV-seq數據與耳蝸的scRNA-seq數據（GSE135913）整合，分(fen)(fen)為8個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞群，每個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞群都(dou)包(bao)含sev和(he)耳蝸細(xi)(xi)胞，這(zhe)表(biao)明CDsEV起(qi)源于許多(duo)不(bu)同的(de)(de)細(xi)(xi)胞類型（圖(tu)7E，F）。在8個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞群中(zhong)(zhong)，SC簇中(zhong)(zhong)sEV的(de)(de)比(bi)例最(zui)高（38%，圖(tu)7G），這(zhe)表(biao)明SC中(zhong)(zhong)每個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞分(fen)(fen)泌的(de)(de)sEV數量最(zui)高。就每個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞群中(zhong)(zhong)sEV的(de)(de)總數而言，SCs和(he)K?lliker’s organ （KO）細(xi)(xi)胞中(zhong)(zhong)sEV的(de)(de)含量最(zui)高，這(zhe)表(biao)明SCs和(he)KOs比(bi)其他(ta)細(xi)(xi)胞群分(fen)(fen)泌更多(duo)的(de)(de)sEV（SCs和(he)KOs中(zhong)(zhong)分(fen)(fen)別(bie)有161和(he)158個(ge)(ge)sEV，圖(tu)7H）。這(zhe)些結果表(biao)明，SCs和(he)KOs具有最(zui)強大的(de)(de)CDsEV分(fen)(fen)泌能(neng)力(li)，是CDsEV的(de)(de)主要來(lai)源。
圖7.單(dan)個CDsEV轉(zhuan)錄組與(yu)耳蝸(gua)scRNA-seq聯(lian)合分析
原(yuan)文鏈(lian)接：Isolation and Comprehensive Analysis of Cochlear Tissue‐Derived Small Extracellular Vesicles - Jiang - Advanced Science - Wiley Online Library
