2025-03-10
文章題目：A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates na?ve-to- primed pluripotency and differentiation
上海交通大學在《Nature Communications》上發表了TGFβ- SMAD信號和DNA甲基化的逐步模式調節原始到啟動的多能性和分化的研究成果，影響因子14.7。本研究中ATAC-seq檢測及部分數據分析工(gong)作均由上(shang)海(hai)派(pai)森諾生物(wu)科技股份有限(xian)公司完成。
01、研究背景
TGF-β信(xin)號(hao)通路(lu)在(zai)小(xiao)鼠胚胎(tai)發(fa)育中扮(ban)演著重要(yao)的角色，包(bao)括(kuo)胚胎(tai)模(mo)式(shi)建立(li)(li)，細胞(bao)命運確定(ding)和(he)(he)動(dong)態運動(dong)等，并且還影響胚胎(tai)干細胞(bao)的多能(neng)性和(he)(he)分化功(gong)能(neng)。經典的TGFβ信(xin)號(hao)傳導主要(yao)通過(guo)Smad2/3與(yu)Smad4形(xing)(xing)成的復合物激(ji)活下游的靶基(ji)因。然而，越(yue)來越(yue)多的研究表明，在(zai)某些情況下，Smad2/3可獨(du)立(li)(li)于(yu)Smad4入(ru)核，并發(fa)揮(hui)調控(kong)作用。在(zai)小(xiao)鼠胚胎(tai)發(fa)育早期，從上胚層中特異性敲除Smad4卻對于(yu)TGF-β掌控(kong)的上胚層的形(xing)(xing)成影響甚微(wei)。因此(ci)探究Smad2/3獨(du)立(li)(li)于(yu)Smad4的調控(kong)機制尤為重要(yao)。
02、技(ji)術路線
03、研究內容(rong)
S2/3DKO和S4KO的的差異轉錄組(zu)分(fen)析
研究首先(xian)利用CRISPR/Cas9技術(shu)生成了Smad2/3雙(shuang)敲除（S2/3DKO）和Smad4敲除（S4KO）的(de)mESCs。轉錄組分析(xi)顯示(shi)S2/3DKO和S4KO之(zhi)間存在明顯差異，S2/3DKO在基因表(biao)達上表(biao)現出更(geng)顯著的(de)變化（圖1A-F）。基因集變異分析(xi)（GSVA）表(biao)明，S2/3DKO和S4KO對(dui)原始內胚層和植入(ru)后上胚層的(de)決定具有不同影響。S2/3DKO促(cu)進(jin)原始內胚層的(de)形成并抑制植入(ru)后上胚層基因的(de)表(biao)達，而S4KO對(dui)這(zhe)些(xie)過程(cheng)的(de)影響較溫和（圖1G-J）。
圖1 mESC分(fen)化過程中Smad2/3和(he)Smad4的差(cha)異要求
在Smad4缺失情況下(xia)，外胚(pei)層(ceng)（Epiblast）可以形成
作(zuo)者將已(yi)建立的(de)(de)(de)(de)系統WT、S2/3DKO和(he)S4KO的(de)(de)(de)(de)mESCs轉(zhuan)化為(wei)外胚(pei)層樣細胞（EpiLCs），結(jie)果發現WT和(he)S4KO mESCs逐漸(jian)發生(sheng)了典型的(de)(de)(de)(de)EpiLCs形(xing)態轉(zhuan)變(bian)，而(er)S2/3DKO mESC保(bao)留(liu)mESC克隆形(xing)式(shi)（圖2A-B）。之后通過 ChIP-seq 和(he) CUT&Tag 技術，檢測 Smad2/3 和(he) Smad4 在(zai)基因(yin)啟動子(zi)和(he)增(zeng)強子(zi)上(shang)的(de)(de)(de)(de)結(jie)合情況。結(jie)果表(biao)明Smad2/3在(zai)促進從(cong)原始mESCs到啟動EpiLCs的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)變(bian)中的(de)(de)(de)(de)關鍵作(zuo)用(yong)(yong)。Smad4作(zuo)為(wei)TGF-β信號傳(chuan)導(dao)的(de)(de)(de)(de)經典Smad2/3-Smad4復(fu)合物的(de)(de)(de)(de)一(yi)部分(fen)，在(zai)誘(you)導(dao)中胚(pei)層調節因(yin)子(zi)中發揮次要(yao)作(zuo)用(yong)(yong)（圖2C-E）。
圖2 Smad4缺失(shi)情況下的外胚層形成
Dnmt3b與Smad2/3互作
作者為了(le)探索Smad2/3獨立調控外胚層基因的(de)潛(qian)在(zai)(zai)機制，對來自WT和S4KO的(de)D3 EBs進(jin)行了(le)Smad2/3質譜(pu)共免疫沉(chen)淀(IP-MS)分(fen)析，結(jie)果發現Smad2/3 可以和 Dnmt3b 相互作用（圖3A-E）。在(zai)(zai)從初始多(duo)能性向(xiang)誘導多(duo)能性轉變(bian)過程中，Smad2/3上(shang)調Dnmt3b，且這種(zhong)上(shang)調對形成上(shang)胚層很重要。在(zai)(zai)野生型（WT）和S4KO細(xi)胞(bao)中敲低Dnmt3b會影響上(shang)胚層基因的(de)表(biao)達，突(tu)顯了(le)Dnmt3b在(zai)(zai)該過程中的(de)重要性（圖3F-H）。
圖3 Dnmt3b與Smad2/3互作
Smad2/3上調(diao)Dnmt3b對外胚層形成至(zhi)關重要(yao)
在(zai)mESC啟(qi)(qi)動過程(cheng)中，Dnmt3b在(zai)S2/3DKO EBs中部分下調，但(dan)在(zai)S2/ 3/4TKO中大(da)部分被阻斷。表(biao)明Smad2/3和Smad4都可(ke)以調節(jie)Dnmt3b的(de)(de)表(biao)達，但(dan)Smad2/3更占(zhan)優(you)勢，Smad2/3在(zai)mESC啟(qi)(qi)動過程(cheng)中刺激Dnmt3b的(de)(de)表(biao)達，從而(er)促進(jin)上皮細(xi)胞的(de)(de)形成。
圖4 Smad2/3上(shang)調Dnmt3b對外(wai)胚層形成非常重(zhong)要
Dnmt3b獨立于Smad4介導(dao)Smad2/3與外胚(pei)層基因結合
作者用(yong)表(biao)(biao)達野生型Dnmt3b的(de)慢病毒載體感染S4KO +Dnmt3b-sh2細胞(催化(hua)失(shi)活的(de)Dnmt3b失(shi)去DNA甲(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)能(neng)力(li)(li))有效地挽(wan)救了Fgf5和T在S4KO+Dnmt3b-sh2 EBs中(zhong)的(de)表(biao)(biao)達，結果表(biao)(biao)明表(biao)(biao)明DNA甲(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)和Dnmt3b的(de)h3k36me2 /3關聯能(neng)力(li)(li)是激活S4KO引物(wu)外胚層(ceng)基(ji)因所必需(xu)的(de)。Dnmt3b能(neng)直接與Smad2/3互(hu)作并促進Smad2/3結合到上(shang)胚層(ceng)順式作用(yong)元(yuan)件中(zhong)心(xin)的(de)低甲(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)區域。始(shi)(shi)發態細胞開始(shi)(shi)分(fen)化(hua)時，Dnmt3b 對(dui)全局基(ji)因組(zu)甲(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)的(de)參與減少，Smad4 接過接力(li)(li)棒，與 Smad2/3 形(xing)成(cheng)復合物(wu)，支(zhi)持中(zhong)內胚層(ceng)的(de)誘導。
圖5 Dnmt3b獨立于(yu)Smad4介導Smad2/3與外胚層基因結合
04、研究(jiu)結論
本研(yan)究通(tong)過(guo)RNA-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq、WGBS等(deng)分析揭示(shi)了(le)Smad2/3在mESCs向(xiang)(xiang)EpiLCs轉變(bian)過(guo)程中(zhong)通(tong)過(guo)誘導(dao)Dnmt3b表(biao)達來調(diao)控DNA甲基(ji)化模式，從而(er)促進原始態多(duo)能性(xing)向(xiang)(xiang)始發態多(duo)能性(xing)的(de)(de)轉變(bian)。同(tong)時還揭示(shi)了(le)在Smad2/3缺失情況下，Smad4單獨不能啟動Epiblast特異性(xing)基(ji)因轉錄。在分化過(guo)程中(zhong)，Dnmt3b活性(xing)降(jiang)低，Smad4與(yu)Smad2/3形成復合物，支持中(zhong)胚(pei)層和(he)內胚(pei)層的(de)(de)誘導(dao)。總之這項工(gong)作闡(chan)明了(le)信號傳(chuan)導(dao)和(he)表(biao)觀遺傳(chuan)的(de)(de)協同(tong)作用機制，進而(er)為理(li)解TGFβ信號在生理(li)學和(he)病理(li)學中(zhong)的(de)(de)作用提供了(le)新的(de)(de)思(si)路(lu)。
原文索引：Zhao B, Yu X, Shi J, Ma S, Li S, Shi H, Xia S, Ye Y, Zhang Y, Du Y, Wang Q. A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates na?ve-to-primed pluripotency and differentiation. Nat Commun. 2024 Nov 22;15(1):10123. doi: 10.1038/s41467-024-54433-5
