2025-03-14
概覽介(jie)紹(shao)
神經元核內包涵體病（NIID）是一種致命的神經退行性疾病，發病機制不明且治療手段有限。南昌大學洪道俊教授團隊在Cell Commun Signal發表文章“uN2CpolyG-mediated p65 nuclear sequestration suppresses the NF-κB-NLRP3 pathway in neuronal intranuclear inclusion disease”，發現 NIID 中 uN2CpolyG 蛋白與 p65 相互(hu)作用，抑(yi)制 NF-κB-NLRP3 通(tong)路，損害自噬功能，加速神經元死亡。
研究(jiu)方法
單細胞測(ce)序(scRNAseq)：采用10x Genomics的單(dan)細胞測序平臺對NIID患者和對照組的細胞進行測序，以分(fen)析細胞類(lei)型(xing)和基因(yin)表達(da)差異。
細胞培養與轉(zhuan)染：研究(jiu)者使用帶有不(bu)同數量CGG重復序列的(de)載(zai)體(ti)轉染細胞，以模擬NIID的(de)病理特征。
Western blotting：用(yong)于檢(jian)測蛋(dan)(dan)白表達(da)水平，特別(bie)是NF-κB通路相關(guan)蛋(dan)(dan)白和自噬相關(guan)蛋(dan)(dan)白。
免疫熒(ying)光染色：觀察蛋白的定位和(he)共定位情況，如p62、p65（NF-κB的一個亞基(ji)）和(he)自噬(shi)相關蛋白LC3B等(deng)。
派森(sen)諾的優勢
本研究中單細胞(bao) RNA 測(ce)序和部(bu)分數據分析工作由上海派(pai)森諾生物科(ke)技股份(fen)有限公司完成，其專(zhuan)業技術為(wei)研究(jiu)的(de)(de)順利開展提供了有力支持，保障了數據的(de)(de)準確性和可靠性，以卓越的(de)(de)服務助力客戶(hu)在科研征途(tu)上不斷突破，勇登學術高(gao)峰。
研究結果
結果1：NIID 組織(zhi)中 NFKBIA 轉錄(lu)水平降低(di)
通(tong)(tong)過(guo)對3例無臨床炎癥(zheng)特征的(de)NIID患(huan)者皮(pi)(pi)膚(fu)樣本進行單細(xi)胞(bao)(bao)RNA測序，研究者發現NIID患(huan)者的(de)多(duo)種細(xi)胞(bao)(bao)類型（包括成纖維細(xi)胞(bao)(bao)、脂肪(fang)細(xi)胞(bao)(bao)、肌上皮(pi)(pi)細(xi)胞(bao)(bao)和(he)汗腺導管上皮(pi)(pi)細(xi)胞(bao)(bao)）中(zhong)存在20個共同的(de)差異表達基因（DEGs）。其(qi)中(zhong)，與NF-κB通(tong)(tong)路相關(guan)的(de)NFKBIA基因（編碼IkBa蛋白(bai)）表達顯著降低。在施(shi)萬細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)，NIID皮(pi)(pi)膚(fu)組(zu)織的(de)NFKBIA mRNA水(shui)平(ping)顯著低于對照組(zu)，表明其(qi)轉錄水(shui)平(ping)下降。由于IkBa蛋白(bai)對NF-κB通(tong)(tong)路的(de)抑制作用至(zhi)關(guan)重要，這種轉錄水(shui)平(ping)的(de)降低可能會影響(xiang)NF-κB通(tong)(tong)路的(de)活(huo)性。
結果(guo)2：NIID 細胞中 IkBa 蛋白水(shui)平降低(di)及(ji)相關(guan)變化
用含有(you)不同(tong)(tong) CGG 重復次數的(de)(de) NOTCH2NLC 質粒（CGG9 為(wei)野生型，CGG69/100 為(wei)突變型）轉染 HEK-293T 細(xi)胞(bao)(bao)后(hou)發(fa)現(xian)，CGG100 細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong) NFKBIA mRNA 和(he) IkBa 蛋白(bai)水平顯著低于 CGG9 細(xi)胞(bao)(bao)。同(tong)(tong)時，CGG100 細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)磷酸化 IkBa 水平升高(gao)，p-IkBa/IkBa 比例(li)增加。而且，CGG100 誘導了 p62 陽性包涵體的(de)(de)形成，IkBa 與 CGG100 細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong) GFP 陽性包涵體存在共(gong)定位現(xian)象，而 CGG9 細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)則無此現(xian)象，這意味著 NF-κB 通路的(de)(de)抑(yi)制狀態可能發(fa)生改變。
結果(guo)3：NIID 細(xi)胞中 p-p65 水平降低抑制 NF-κB 通路
在(zai)(zai)轉染了CGG100細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)，p-p65/p65 比(bi)例在(zai)(zai)轉染 24h 后達(da)(da)到(dao)峰值，隨后逐漸下降(jiang)(jiang)(jiang)，48h 時顯(xian)著(zhu)低(di)(di)(di)于轉染CGG9的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)。盡管總 p65 蛋白水(shui)平(ping)在(zai)(zai) CGG100 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong) 48h 時無明顯(xian)變化，但核(he)(he)質分離實驗顯(xian)示，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)質 p65 水(shui)平(ping)降(jiang)(jiang)(jiang)低(di)(di)(di)，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he) p65 水(shui)平(ping)升(sheng)高，且細(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)中(zhong) p-p65 水(shui)平(ping)顯(xian)著(zhu)降(jiang)(jiang)(jiang)低(di)(di)(di)。此外，qPCR 檢(jian)測(ce)發現(xian) CGG100 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong) IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等炎癥因子表(biao)達(da)(da)水(shui)平(ping)顯(xian)著(zhu)降(jiang)(jiang)(jiang)低(di)(di)(di)，表(biao)明 p-p65 水(shui)平(ping)降(jiang)(jiang)(jiang)低(di)(di)(di)抑制了 NF-κB 通路活性，影(ying)響(xiang)了炎癥反(fan)應相(xiang)關基因的表(biao)達(da)(da)。
結(jie)果4：uN2CpolyG 與 p65 相互(hu)作用(yong)抑(yi)制其磷酸(suan)化
分(fen)子(zi)對(dui)接模擬顯(xian)示 p65 與(yu) uN2CpolyG 有潛在(zai)(zai)相(xiang)(xiang)互作用(yong)，co-IP 實驗進一步證實了(le)在(zai)(zai) CGG100 細(xi)胞(bao)(bao)中 uN2CpolyG-GFP 和(he) p65 之間存(cun)在(zai)(zai)蛋白 - 蛋白相(xiang)(xiang)互作用(yong)。免疫熒光染(ran)色顯(xian)示，在(zai)(zai) CGG100 細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)質和(he)細(xi)胞(bao)(bao)核中，p65 與(yu) uN2CpolyG-GFP 存(cun)在(zai)(zai)顯(xian)著共定位現(xian)象，轉染(ran) CGG69 質粒的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)中也有類似結果。這表明 NF-κB/p65 活性的(de)(de)(de)降低與(yu) uN2CpolyG 包涵體的(de)(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)密切相(xiang)(xiang)關，但對(dui) NIID 發病的(de)(de)(de)具體利弊仍有待確定。
結果(guo)5：降低 NF-κB 活性加劇 NIID 病理表(biao)型
用(yong) NF-κB 激活劑(ji)（LPS）或抑(yi)(yi)制(zhi)劑(ji)（curcumin）處(chu)理(li)轉(zhuan)染了(le)(le)含 CGG100細(xi)(xi)(xi)胞(bao)發現，30μg/ml LPS 可降(jiang)低 uN2CpolyG 產生、減少包(bao)涵體形(xing)成(cheng)并提高細(xi)(xi)(xi)胞(bao)活力，而curcumin等抑(yi)(yi)制(zhi)劑(ji)會(hui)(hui)加劇 NF-κB 抑(yi)(yi)制(zhi)，增(zeng)加 uN2CpolyG 水平并降(jiang)低細(xi)(xi)(xi)胞(bao)活力。此外，siRNA 介導的 p65 敲低會(hui)(hui)導致 uN2CpolyG 聚集增(zeng)加。在轉(zhuan)染 CGG69 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和 U87 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)系中(zhong)也得到了(le)(le)類(lei)似(si)結果。這表明增(zeng)強 NF-κB 活性(xing)可能(neng)改善 NIID 病理(li)特(te)征，而抑(yi)(yi)制(zhi)其活性(xing)會(hui)(hui)使(shi)病情(qing)惡(e)化。
結果(guo)6：降低(di) NF-κB 活性通過抑制(zhi)自噬增(zeng)加包涵體
在轉染的(de)(de)(de) CGG100 細(xi)胞中(zhong)，雖然 mTOR 水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)無明(ming)顯變(bian)化，但(dan) p-AMPK 水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)升高，表明(ming)細(xi)胞試(shi)圖啟動(dong)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)(shi)。然而(er)，隨著 p-p65/p65 比例降(jiang)(jiang)低，CGG100 相(xiang)比 CGG9 細(xi)胞，Beclin 1 和(he)(he) LC3II 水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)顯著降(jiang)(jiang)低，溶(rong)(rong)酶體(ti)(ti)數量也減少(shao)，表明(ming)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)(shi)通(tong)量受損，不溶(rong)(rong)性的(de)(de)(de) uN2CpolyG 水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)增(zeng)(zeng)加。用 LPS 處理可增(zeng)(zeng)加 p-p65/p65 和(he)(he) LC3II/LC3I 比例并(bing)減少(shao) p62 水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)，而(er)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)(shi)抑(yi)制劑 3-MA 可減弱(ruo) LPS 降(jiang)(jiang)低不溶(rong)(rong)性的(de)(de)(de) uN2CpolyG 水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)的(de)(de)(de)能力，Beclin 1 敲低會(hui)增(zeng)(zeng)加 uN2CpolyG 水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)。轉染 CGG69 質粒的(de)(de)(de)細(xi)胞中(zhong)也觀察到類(lei)似現象，說(shuo)明(ming) NF-κB 活性降(jiang)(jiang)低可通(tong)過抑(yi)制自(zi)(zi)噬(shi)(shi)(shi)導致(zhi)包涵體(ti)(ti)增(zeng)(zeng)加，兩者聯(lian)系緊密。
結果(guo)7：NF-κB 活性降低(di)后 NLRP3 導致自噬減少
在(zai) CGG100 細胞中，NF - κB 活性(xing)降低(di)(di)時(shi)，NLRP3 及下游蛋白表達(da)顯(xian)(xian)著下降。LPS 處理(li)可提升 p - p65/p65、NLRP3 和(he) LC3II/LC3I 水平(ping)(ping)，curcumin 處理(li)則反之。敲低(di)(di) p65 會使 NLRP3 水平(ping)(ping)和(he) LC3II/LC3I 比例降低(di)(di)。共聚焦顯(xian)(xian)微(wei)鏡和(he)免疫熒(ying)光染色顯(xian)(xian)示 NLRP3 與 LC3B 在(zai) CGG9 細胞中顯(xian)(xian)著共定位(wei)，而在(zai) CGG100 細胞中觀(guan)察到極小的(de)共定位(wei)。這說明NLRP3 炎性(xing)小體可能在(zai) NID 個體 NF-κB 通(tong)路(lu)活性(xing)降低(di)(di)后(hou)的(de)自噬(shi)功(gong)能障礙中發(fa)揮關鍵(jian)作用。
結果(guo)8：適當激活 NF-κB 改善果(guo)蠅(ying) NIID 表型
在果(guo)蠅 NIID 模(mo)型(xing)中，轉基因果(guo)蠅出現(xian)運(yun)動能力(li)下(xia)降、壽命(ming)縮短(duan)和腦(nao)內包(bao)涵體(ti)等癥狀(zhuang)。用(yong)不同濃(nong)度 LPS 處理后(hou)，發現(xian) 100μM LPS 在第(di) 30 天可(ke)顯(xian)著改(gai)善(shan)運(yun)動能力(li)，1μM LPS 可(ke)延長(chang)壽命(ming)并(bing)減(jian)少腦(nao)內包(bao)涵體(ti)數量，但 1mM LPS 會(hui)產(chan)生有害影響。這表明(ming)適(shi)當(dang)激活 NF-κB 對改(gai)善(shan) NIID 表型(xing)有積極作用(yong)，與細(xi)胞(bao)實(shi)驗結(jie)果(guo)相(xiang)互印證。
結論(lun)
本研(yan)究揭(jie)示了神(shen)經元核內包(bao)涵體病（NIID）的(de)重要發(fa)病機制：uN2CpolyG 蛋白與 p65 結(jie)合，抑制 NF-κB-NLRP3 通路，使自噬關鍵(jian)蛋白減少(shao)，毒性蛋白積(ji)累，加速神(shen)經元死亡。不過，激活 NF-κB（如用 LPS）可減少(shao)包(bao)涵體、改善(shan)果蠅運動能力，為 NIID 藥物研(yan)發(fa)提供了方向，有望推動針對該(gai)病的(de)治療取(qu)得新(xin)突破。
