2025-03-30
近日，沈陽農業大學在生物學領域的《International Journal of Molecular Sciences》發表新(xin)研究成果！本研究從EMS誘變(bian)群體(ti)中獲得(de)了一個卷(juan)葉突變(bian)體(ti)cl1，并將其命名為Brcl1YS，測序驗證(zheng)確定了Brc11YS的(de)(de)候(hou)選區間(jian)位于A02染色體(ti)上(shang)的(de)(de)97.5 kb區域。序列差異(yi)和共分(fen)離驗證(zheng)證(zheng)實，BraA02g017030.3C是Brc11YS位點(dian)最(zui)有可能的(de)(de)候(hou)選基因(yin)。本研究結果將為進(jin)一步的(de)(de)定位克(ke)隆和功(gong)能研究提供(gong)線(xian)索，并為闡明白菜卷(juan)葉性狀的(de)(de)分(fen)子機制提供(gong)良好基礎。
本研究的BSR測序和分析由上海派森諾生物科(ke)技股份有限公司(si)完成。
研(yan)究背(bei)景
甘藍型油(you)菜(cai)（Brassica rapa）作(zuo)為(wei)一種重(zhong)(zhong)要(yao)的(de)(de)(de)農作(zuo)物(wu)在全球廣(guang)泛種植(zhi)，主要(yao)用(yong)(yong)于其(qi)葉(xie)菜(cai)類蔬菜(cai)，其(qi)也部(bu)分(fen)(fen)用(yong)(yong)于飼料和(he)油(you)籽生(sheng)產(chan)。葉(xie)片(pian)形狀對植(zhi)物(wu)的(de)(de)(de)光合作(zuo)用(yong)(yong)和(he)產(chan)量具有(you)重(zhong)(zhong)要(yao)意義(yi)，適度的(de)(de)(de)葉(xie)片(pian)卷曲(qu)能夠通(tong)過(guo)增強光吸收(shou)和(he)減少水分(fen)(fen)流失來提(ti)高(gao)植(zhi)物(wu)的(de)(de)(de)光合效率和(he)適應能力，從而(er)促(cu)進作(zuo)物(wu)產(chan)量的(de)(de)(de)提(ti)升。葉(xie)片(pian)形態的(de)(de)(de)形成是(shi)一個(ge)(ge)復雜的(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)學過(guo)程，受(shou)到外部(bu)環境、內部(bu)基因表達水平以及激素(su)(su)水平的(de)(de)(de)多重(zhong)(zhong)調控。已有(you)研究表明(ming)，生(sheng)長素(su)(su)的(de)(de)(de)不(bu)均勻分(fen)(fen)布是(shi)導致葉(xie)片(pian)卷曲(qu)的(de)(de)(de)重(zhong)(zhong)要(yao)因素(su)(su)之(zhi)一，而(er)赤霉素(su)(su)作(zuo)為(wei)一種關鍵的(de)(de)(de)植(zhi)物(wu)激素(su)(su)，在植(zhi)物(wu)生(sheng)長發育的(de)(de)(de)多個(ge)(ge)階(jie)段發揮著重(zhong)(zhong)要(yao)作(zuo)用(yong)(yong)，但其(qi)在葉(xie)片(pian)卷曲(qu)中的(de)(de)(de)具體作(zuo)用(yong)(yong)尚未被充分(fen)(fen)揭(jie)示。
研究(jiu)材料與(yu)方法
1.實驗材(cai)料(liao)：Rapid Cycling Brassica rapa（RcBr）通過EMS誘變(bian)得到(dao)卷葉(xie)突變(bian)體(ti)1（Brcl1），Brcl1與黃(huang)沙遜（YS）雜(za)交(jiao)后(hou)自(zi)交(jiao)獲得F2分離群體(ti)。從F2分離群體(ti)中(zhong)選出(chu)10株(zhu)卷葉(xie)表型個體(ti)，與輪回親本YS連續回交(jiao)三(san)次(ci)并自(zi)交(jiao)一次(ci)，從中(zhong)選育出(chu)攜帶卷葉(xie)性狀的個體(ti)并命名為Brc11YS。通過Brc11YS與YS的雜(za)交(jiao)，構建(jian)了(le)新的NIL-F2群體(ti)（500株(zhu)）。
2.測(ce)序平臺(tai)：Illumina
3.分(fen)析(xi)內容：BSR-Seq測序分析、遺傳圖(tu)譜構建、候選(xuan)基(ji)因預測及共分離驗證和(he)qRT-PCR驗證
研究結果
表(biao)型鑒定
在(zai)15-50天的相似生(sheng)長時間(jian)內分(fen)別選取10個(ge)(ge)個(ge)(ge)體來檢測(ce)兩個(ge)(ge)親本Brcl1YS和(he)YS質檢的差異(yi)，與YS相對(dui)，Brcl1YS的葉(xie)片向上卷曲(qu)、起皺且植株(zhu)較矮。在(zai)45天后，進一步測(ce)定了株(zhu)高、莖粗、葉(xie)長和(he)葉(xie)寬。所有四個(ge)(ge)指標，在(zai)YS和(he)Brcl1YS之間(jian)均顯示(shi)出顯著(zhu)差異(yi)。
圖1 表型鑒定
突變(bian)體卷葉性狀的遺傳分析
正反(fan)交F1代的表型與卷(juan)(juan)葉(xie)親(qin)本(ben)Brcl1YS沒(mei)有差異(yi)(yi)。F1代和反(fan)交F1代個體之間沒(mei)有觀察(cha)到(dao)顯著差異(yi)(yi)，兩(liang)者都表現出(chu)卷(juan)(juan)葉(xie)表型，與卷(juan)(juan)葉(xie)親(qin)本(ben)Brcl1YS相似(si)。隨(sui)后的F2群體的分(fen)(fen)離比例符合預期(qi)的孟德爾分(fen)(fen)離比例3:1（卷(juan)(juan)葉(xie)vs正常葉(xie)）。可以得出(chu)結論，卷(juan)(juan)葉(xie)性(xing)狀是由B. rapa中的一對顯性(xing)基(ji)因控制的。
表1 Brcl1YS遺(yi)傳特征分析
BSR分析
為了(le)確(que)定(ding)Brcl1YS的(de)候(hou)選區(qu)(qu)間(jian)，分別(bie)從N池(chi)和(he)C池(chi)中獲得(de)了(le)45,494,770和(he)46,962,128條高質量reads，并將其(qi)比對到(dao)B. rapa參考基因組。BSR-seq數據中共(gong)鑒定(ding)出(chu)197,180個SNP和(he)210,789個InDel，每個變(bian)異位(wei)點均用于計算ED5值。結果(guo)表明，Brcl1YS的(de)候(hou)選區(qu)(qu)域包括兩(liang)個區(qu)(qu)域：一個位(wei)于A02染(ran)色(se)體的(de)8,426,511bp-9,253,907bp；另一個位(wei)于A10染(ran)色(se)體的(de)16,103,255bp-17,842,04bp。
圖2 BSR分析
Brcl1YS基因的精細定位
根據BSR-seq的結果，在兩個候選(xuan)區(qu)間內均(jun)勻開發(fa)了10對InDel引物(wu)。連鎖分析顯示，位(wei)(wei)于(yu)A02染(ran)色體（8,426,511 - 9,253,907）的第一(yi)(yi)(yi)個區(qu)間與Brcl1YS位(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)相(xiang)關聯。利用包(bao)含(han)717個個體的F2代隱性純合群體，將(jiang)候選(xuan)區(qu)間進一(yi)(yi)(yi)步縮小。其中，Indel79、Indel83、Indel86、Indel87、SNP15、SNP3和SNP2位(wei)(wei)于(yu)Brcl1YS位(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)的一(yi)(yi)(yi)側，而SNP14和SNP1位(wei)(wei)于(yu)Brcl1YS位(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)的另(ling)一(yi)(yi)(yi)側。SNP2和SNP14與Brcl1YS位(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)緊密(mi)連鎖，其遺傳距離(li)分別為0.20厘摩和0.42厘摩。最(zui)終，Brcl1YS位(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)被定位(wei)(wei)到一(yi)(yi)(yi)個97.5 kb的物(wu)理候選(xuan)區(qu)間內。
圖3 精細定位結果
候(hou)選基因(yin)的序列變異和共分離驗證
根(gen)據(ju)數據(ju)庫比對查(cha)找同源基因，發現(xian)共有12個(ge)(ge)基因（BraA02g017010.3C - BraA02g017120.3C）位于候(hou)(hou)選(xuan)區間內。結果顯(xian)示，BraA02g017030.3C的(de)(de)全長為1524 bp，包含一(yi)個(ge)(ge)外顯(xian)子(zi)和508個(ge)(ge)氨(an)基酸。與(yu)YS相比，Brcl1YS的(de)(de)啟動子(zi)序列(lie)保持不變，但其CDS序列(lie)包含五個(ge)(ge)非同義SNP突(tu)變。由于G突(tu)變為A，導致(zhi)(zhi)第1364位的(de)(de)天冬(dong)氨(an)酸變為絲氨(an)酸，這一(yi)突(tu)變與(yu)EMS突(tu)變特征一(yi)致(zhi)(zhi)。共分離引物發現(xian)這一(yi)突(tu)變存在于十五個(ge)(ge)隱性F2個(ge)(ge)體中，BraA02g017030.3C是最有可能的(de)(de)候(hou)(hou)選(xuan)基因。
圖4 候選基因(yin)序列(lie)分析(xi)和(he)共分離(li)候選基因(yin)驗證
BraA02g017030.3C的(de)表達(da)模式分析
為了分析BraA02g017030.3C的(de)表達(da)水平，分別從YS和Brcl1YS的(de)不(bu)同器官以及(ji)不(bu)同發育時期的(de)葉片(pian)(pian)進行qPCR實驗(yan)。結果(guo)顯示，BraA02g017030.3C在(zai)每個(ge)器官中(zhong)(zhong)均有表達(da)，且在(zai)第一片(pian)(pian)真葉中(zhong)(zhong)的(de)表達(da)量(liang)最(zui)高。
圖(tu)5 雙親中BraA02g017030.3C的表達譜
結 論
本研究鑒(jian)定了一(yi)個(ge)EMS突(tu)變體(ti)(ti)Brcl1YS，與受體(ti)(ti)親(qin)本黃(huang)沙遜(xun)（YS）相(xiang)比(bi)，葉片(pian)顯著卷曲。通(tong)過BSR-seq測序(xu)和(he)重組篩選(xuan)，確定了Brcl1YS 的(de)候(hou)選(xuan)區間位于A02染色(se)體(ti)(ti)上的(de)97.5 kb區域(yu)。在該候(hou)選(xuan)區域(yu)內鑒(jian)定出12個(ge)基因(yin)。序(xu)列差異和(he)共分(fen)離驗證證實，BraA02g017030.3C是Brcl1YS位點(dian)最有可(ke)能的(de)候(hou)選(xuan)基因(yin)。它與擬南芥(jie)的(de)RGL1同源，屬于DELLA蛋白，參與赤霉素(su)信號通(tong)路。這些結果有助于理解葉片(pian)形態發生(sheng)的(de)機制，并(bing)為白菜的(de)改良(liang)提(ti)供遺(yi)傳資源。
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文章索引：Wang, Lihui, et al. "Identification and Candidate Gene Analysis of Brcl1, a Novel Gene Confers a Leaf Curled Phenotype in Brassica rapa L." International Journal of Molecular Sciences 26.2 (2025): 732.
