2025-04-11
文章題目: miR-29b-triggered epigenetic regulation of cardiotoxicity following exposure to deltamethrin in zebrafish
技術手(shou)段：miRNA測(ce)序、mRNA測(ce)序、顯微(wei)注(zhu)射(she)、免疫熒光染(ran)色、組織學染(ran)色、qPCR等
浙江大學李(li)舒盈在《Journal of Hazardous Materials》上發表了通過(guo)mRNA測序和miRNA測序等技(ji)術揭示(shi)了溴氰菊(ju)酯誘導的(de)斑馬魚(yu)心臟毒(du)性(xing)及其(qi)表觀遺傳調控機制(zhi)，特(te)別是miR-29b的(de)上調和dnmts的(de)抑制(zhi)在心臟發育異常(chang)中(zhong)的(de)關鍵(jian)作用。
本(ben)研究的mRNA測序(xu)和(he)miRNA測序(xu)以(yi)及部分數據(ju)分析工作由(you)上海派森諾生物科技股份(fen)有限公司(si)完成。
文章亮點
1.綜(zong)合技術手段：結合miRNA測序、mRNA測序、顯微注(zhu)射、免疫熒光染色(se)等多種技術(shu)，全(quan)面解(jie)析了溴(xiu)氰菊酯(zhi)的心臟(zang)毒性及其分子(zi)機制。
2.功能(neng)驗(yan)證實驗(yan)：通過miR-29b模擬物和抑(yi)制劑(ji)的(de)注射實驗，驗證了miR-29b在心臟毒(du)性中的(de)關(guan)鍵作用，并進一步探(tan)討(tao)了其與DNA甲基轉移酶（dnmts）的(de)關(guan)系。
3.跨代毒性：發現溴氰(qing)菊酯的表觀遺傳效應可以傳遞給后代，導(dao)致F1代胚胎中miR-29b表達上調和dnmt1表達下調，進一步證實(shi)了(le)其跨(kua)代毒(du)性。
4.dnmts的調控機制解(jie)析：揭(jie)示(shi)了miR-29b通過抑制(zhi)dnmts（DNA甲基轉移(yi)酶）導(dao)致低(di)甲基化，從而影響(xiang)心臟發育相關(guan)基因的表達。
研究背(bei)景
溴(xiu)(xiu)氰(qing)菊(ju)酯(zhi)(zhi)（deltamethrin）是一種廣泛使用(yong)的(de)(de)擬除蟲菊(ju)酯(zhi)(zhi)類(lei)(lei)殺蟲劑，常(chang)(chang)用(yong)于農業(ye)、水產(chan)養殖和(he)醫藥領域。研究表(biao)明，溴(xiu)(xiu)氰(qing)菊(ju)酯(zhi)(zhi)對(dui)水生生物(wu)具有(you)毒性(xing)(xing)，尤其是在發(fa)育中(zhong)的(de)(de)魚類(lei)(lei)中(zhong)，可誘導心(xin)臟畸形等發(fa)育異常(chang)(chang)。此外，溴(xiu)(xiu)氰(qing)菊(ju)酯(zhi)(zhi)還可能通過表(biao)觀遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)機(ji)制（如miRNA和(he)DNA甲(jia)基化）對(dui)生物(wu)體產(chan)生跨代毒性(xing)(xing)效(xiao)應。然而(er)，關于溴(xiu)(xiu)氰(qing)菊(ju)酯(zhi)(zhi)對(dui)斑馬魚發(fa)育的(de)(de)表(biao)觀遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)影響(xiang)的(de)(de)研究相對(dui)較少。因此，本研究旨(zhi)在探討溴(xiu)(xiu)氰(qing)菊(ju)酯(zhi)(zhi)誘導的(de)(de)心(xin)臟毒性(xing)(xing)和(he)其潛在的(de)(de)表(biao)觀遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)調控機(ji)制。
技(ji)術路線
主要研(yan)究(jiu)結果(guo)
1.溴(xiu)氰菊酯暴(bao)露影響斑(ban)馬魚繁殖并導致后代心臟(zang)異常(chang)
本研究(jiu)設置(zhi)了不(bu)同濃(nong)度的(de)處理組(zu)，以觀察斑馬魚在(zai)溴氰(qing)菊(ju)酯環境下(xia)所受(shou)影響(xiang)。結果表明，親代(dai)(dai)斑馬魚暴(bao)露于溴氰(qing)菊(ju)酯會導致后代(dai)(dai)在(zai)受(shou)精率(lv)、心包水腫率(lv)、心率(lv)和(he)死亡率(lv)方面的(de)顯著變化(hua)，尤其是雄性斑馬魚的(de)繁殖能力受(shou)到更(geng)大影響(xiang)。這(zhe)表明溴氰(qing)菊(ju)酯對斑馬魚的(de)繁殖和(he)后代(dai)(dai)發育(yu)具(ju)有顯著的(de)毒性效(xiao)應）（圖1A-F）。
圖(tu)1：成年斑馬魚暴露于溴氰菊酯后，其繁殖性能和后代發(fa)育(yu)的影響
2.溴氰(qing)菊(ju)酯暴露(lu)誘(you)導(dao)斑馬魚心(xin)包水(shui)腫(zhong)
斑馬魚(yu)幼體心(xin)(xin)包熒光染色、心(xin)(xin)率以及心(xin)(xin)包面積測定結果顯示，溴氰(qing)菊(ju)酯(zhi)暴露對(dui)斑馬魚(yu)幼蟲的(de)心(xin)(xin)臟(zang)發育和(he)功能具(ju)有顯著的(de)毒性效應，表現為心(xin)(xin)包水腫和(he)心(xin)(xin)率下降（圖(tu)2B、C），且這種效應呈劑(ji)量依(yi)賴性。這提示溴氰(qing)菊(ju)酯(zhi)可(ke)能通(tong)過干擾心(xin)(xin)臟(zang)發育相(xiang)關機制來誘導心(xin)(xin)臟(zang)毒性。
圖2：斑(ban)馬(ma)魚(yu)幼體心(xin)包熒(ying)光染(ran)色、心(xin)率以及心(xin)包面積
3.miRNA和mRNA測序和生物信(xin)息學(xue)分析
本(ben)研究對(dui)CK組(zu)和(he)(he)25μg/L溴氰(qing)菊酯暴(bao)露(lu)處(chu)理組(zu)的miRNA和(he)(he)mRNA測序(xu)，進(jin)一步探知溴氰(qing)菊酯對(dui)斑(ban)馬(ma)魚發育的表觀遺傳影(ying)響。
差(cha)異(yi)分析得到9個差(cha)異(yi)miRNA（圖(tu)(tu)A），先前的(de)研究表(biao)明，miR-29b除了在(zai)心(xin)肌(ji)纖維形成中的(de)作(zuo)用(yong)外(wai)，還可(ke)以調節心(xin)臟發育，因(yin)此選擇miR-29b進一(yi)步(bu)分析。并(bing)且(qie)通過不同物種miR-29b序列保守性(xing)的(de)比較（圖(tu)(tu)B）和(he)分析斑馬魚、人類和(he)小鼠中的(de)表(biao)達分布(bu)（圖(tu)(tu)C）獲知dre-miR-29b和(he)hsa-miR-29b可(ke)能(neng)與(yu)下游(you)基(ji)因(yin)具有相似的(de)靶向關系(xi)。
通(tong)過(guo)TargetScanFish進(jin)行(xing)靶基(ji)因(yin)預測，并與(yu)差異mRNA取(qu)交集(ji)(ji)，獲得98個(ge)上調(diao)(diao)基(ji)因(yin)和(he)26個(ge)下(xia)調(diao)(diao)基(ji)因(yin)。使用Metascape中(zhong)(zhong)的人類(lei)數據庫對dre-miR-29b調(diao)(diao)節的DEGs進(jin)行(xing)KEGG富集(ji)(ji)分析，結果(guo)表明與(yu)miR-29b相關的調(diao)(diao)節性DEGs主要富集(ji)(ji)在神經元發育(yu)、心肌肥大和(he)疾病信號傳導中(zhong)(zhong)（圖4D）。
用(yong)(yong)KoBas預測了dre-miR-29b的作用(yong)(yong)機制(zhi)，這證(zheng)實(shi)了miR-29b靶向的DEGs可以與心臟發(fa)育和DNA甲基(ji)化相關的標記基(ji)因相互作用(yong)(yong)（圖(tu)4E）。
綜上，作(zuo)者推測溴氰菊酯暴(bao)露(lu)引起的心臟毒性(xing)很可能與(yu)miR-29b的上調有(you)關。
圖(tu)3：miRNA、mRNA測(ce)序分析以及miR-29b調控網絡
4.miR-29b異常表達干(gan)擾(rao)心臟發育和(he)功能
miR-29b模擬物和(he)(he)抑制(zhi)劑注射后的(de)(de)斑馬魚心(xin)包面(mian)積、心(xin)率和(he)(he)心(xin)包水(shui)腫率（圖4C-F），以及心(xin)臟(zang)相關(guan)基因(yin)（nppa、nppb、foxo3a）表達(da)(da)的(de)(de)影響(xiang)表達(da)(da)變化(hua)（圖4G-I）。這些(xie)結果表明，miR-29b的(de)(de)過表達(da)(da)對斑馬魚心(xin)臟(zang)發育和(he)(he)功(gong)能(neng)具有顯著的(de)(de)負(fu)面(mian)影響(xiang)，表現為心(xin)包水(shui)腫、心(xin)率下降和(he)(he)心(xin)臟(zang)相關(guan)基因(yin)表達(da)(da)的(de)(de)異常。而抑制(zhi)miR-29b則能(neng)夠減輕這些(xie)異常。
圖4：注射miR-29b模擬物和抑(yi)制劑后(hou)幼魚表型變化
5.通過抑制dnmts過表達miR-29b誘導畸形
鑒于miR-29b和(he)心臟基因之(zhi)間(jian)沒有直接結合位點，先(xian)前的(de)(de)一(yi)項研究證實，miR29b反向(xiang)(xiang)調節dnmts，并且(qie)由(you)于抑制dnmts導(dao)(dao)致(zhi)的(de)(de)低甲基化會導(dao)(dao)致(zhi)斑馬魚發育畸形。miR-29b可能靶向(xiang)(xiang)dnmt6和(he)dnmt8，同時影響dnmt1。
為(wei)了實現對dnmts的(de)抑(yi)制(zhi)，將DNA甲基(ji)轉移酶（dnmt）抑(yi)制(zhi)劑5-氮雜(za)胞(bao)苷（5-aza）注射(she)到1-4細胞(bao)胚胎中(zhong)。發現注射(she)5-氮雜(za)胞(bao)苷導致(zhi)心包(bao)面積顯著(zhu)增(zeng)加，心率降低等，5-氮雜(za)胞(bao)苷和溴(xiu)氰菊酯的(de)組合會導致(zhi)更嚴重(zhong)心臟畸形變化(hua)（圖5I-L）。
圖(tu)5：抑制(zhi)斑馬魚(yu)胚(pei)胎中dnmts誘導的心臟疾病
6.成年(nian)和(he)幼魚的(de)miR-29b 和(he)dmnt1在不同處(chu)理下的(de)變(bian)化
結果表(biao)明(ming)，溴(xiu)氰(qing)(qing)菊(ju)酯(zhi)的表(biao)觀遺傳效應可以傳遞給(gei)后代(dai)(dai)，導(dao)致F1代(dai)(dai)胚胎中miR-29b表(biao)達上調和(he)dnmt1表(biao)達下調。這(zhe)表(biao)明(ming)溴(xiu)氰(qing)(qing)菊(ju)酯(zhi)通過(guo)影響(xiang)親(qin)代(dai)(dai)的表(biao)觀遺傳機(ji)制，對后代(dai)(dai)的心(xin)臟發育和(he)功能產生負面影響(xiang)。這(zhe)些發現進一步支持了溴(xiu)氰(qing)(qing)菊(ju)酯(zhi)誘導(dao)的心(xin)臟毒性和(he)其(qi)跨代(dai)(dai)效應的表(biao)觀遺傳機(ji)制。
圖(tu)6：F0和F1代斑馬魚(yu)中的表觀遺(yi)傳效應
研究結論(lun)
實(shi)驗發現，溴氰(qing)菊(ju)酯暴露(lu)會影響斑(ban)馬(ma)魚心(xin)(xin)包面積、心(xin)(xin)率和心(xin)(xin)包水(shui)腫(zhong)率等表(biao)型變(bian)化。miRNA和mRNA測(ce)序分析(xi)發現，miR-29b靶向DEGs富集在心(xin)(xin)臟毒(du)性相關通路，推測(ce)miR-29b可能影響心(xin)(xin)臟毒(du)性。miR-29b的過表(biao)達(da)和抑制實(shi)驗表(biao)現出(chu)其對(dui)斑(ban)馬(ma)魚心(xin)(xin)臟發育(yu)和功(gong)能具有(you)顯著的負面影響，證實(shi)miR-29b在溴氰(qing)菊(ju)酯誘導的心(xin)(xin)臟毒(du)性中起(qi)關鍵(jian)作用。
鑒于(yu)miR-29b和心臟基(ji)因(yin)(yin)(yin)之間(jian)沒(mei)有直接結合位點,但miR29b反向調(diao)節dnmts（DNA甲基(ji)轉(zhuan)移酶），推測dnmts可能是(shi)miR-29b干(gan)擾心臟發育的(de)關(guan)鍵因(yin)(yin)(yin)素。并(bing)且通過(guo)注射DNA甲基(ji)轉(zhuan)移酶（DNMT）抑制(zhi)劑5-氮雜胞(bao)苷（5-aza），斑馬(ma)魚心包面積(ji)表(biao)型發生變化(hua)，心臟相關(guan)因(yin)(yin)(yin)子相關(guan)的(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)mRNA表(biao)達也顯示出(chu)異常。
綜上結果表(biao)明(ming)，miR-29b 通過(guo)抑制(zhi) dnmts 導致心(xin)(xin)臟相(xiang)關(guan)基因的(de)(de)異常表(biao)達，從而引發心(xin)(xin)臟畸形。本研究(jiu)有助于了解糖尿病引起的(de)(de)心(xin)(xin)臟毒性及其潛在的(de)(de)表(biao)觀遺傳毒性機制(zhi)，為評估其風(feng)險提(ti)供參考。
原文鏈(lian)接：//www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0304389424017928
