2025-04-12
近日，中國(guo)農業大學李勝利教授(shou)團(tuan)隊在國(guo)際權威期刊(kan)《Microbiome》發(fa)表題為(wei)“Rumen microbiome associates with postpartum ketosis development in dairy cows: a prospective nested case–control study”科研成果(guo)，此項突破性(xing)成果(guo)創下奶(nai)(nai)牛酮病研究領域SCI期刊(kan)影響因子新高。該研究通過前瞻性(xing)巢式病例對(dui)照設計(ji)，首次證明產(chan)(chan)后瘤胃菌群失衡是圍產(chan)(chan)期奶(nai)(nai)牛能量代謝紊亂的關(guan)鍵誘因，并建(jian)立瘤胃菌群-能量代謝-疾病發(fa)生的因果(guo)關(guan)系，不僅為(wei)酮病防(fang)控(kong)提(ti)供(gong)了新思路,也為(wei)開(kai)發(fa)微生態制(zhi)劑、精準營養調控(kong)方案提(ti)供(gong)了靶點。
派(pai)森(sen)諾提供了微生物(wu)多樣(yang)性(xing)、宏基因組和(he)代謝組測序和(he)部分(fen)(fen)分(fen)(fen)析服務。
圖1 整體(ti)實驗設計圖
研究方法
1.目的：以酮(tong)病奶牛(niu)和(he)健康奶牛(niu)的瘤胃內(nei)容物為研(yan)究(jiu)對象，通過(guo)16 S rRNA、宏基因組(zu)和(he)代謝組(zu)測序手(shou)段分析瘤胃中微生物組(zu)成(cheng)及其功(gong)能(neng)，并與瘤胃發酵參數建立相關性，探究(jiu)瘤胃微生物組(zu)在能(neng)量代謝中的作用和(he)酮(tong)病發病機制。
2.分組設計：在(zai)預產期的第-21、1、3、7、14和21天(tian)測量血液中β-羥丁(ding)酸（BHBA）濃(nong)度來診斷酮病。共檢出61頭(tou)奶牛(niu)為(wei)酮病組(zu)（KET），84頭(tou)奶牛(niu)為(wei)健康組(zu)（CON）。
3.測序平(ping)臺： Illumina novaseq 6000、Illumina novaseq Xplus
4.測序區域：細(xi)菌16s V3-V4區、宏基因組(zu)
5.其他分析：發酵參數檢測、代謝物檢測、生產(chan)性能(neng)檢測、絕對(dui)定(ding)量分析等。
研究結果
1、瘤胃(wei)微生物發酵(jiao)與(yu)能量(liang)代謝有(you)關
測定血清中(zhong)BHBA、葡萄糖（GLU）、非酯(zhi)(zhi)化脂(zhi)肪酸（EFAN）和(he)甘油三(san)酯(zhi)(zhi)（TG）濃(nong)度(du)(du)，以(yi)表征圍產期能量代謝的動態變化。與(yu)(yu)CON組相(xiang)(xiang)比(bi)(bi)，KET組的產后平均BHBA濃(nong)度(du)(du)顯(xian)著升高，GLU濃(nong)度(du)(du)顯(xian)著降(jiang)低，NEFA濃(nong)度(du)(du)較高（圖(tu)(tu)2a）。除(chu)丁酸鹽和(he)“其他VFA”比(bi)(bi)例外，所有瘤(liu)胃發酵(jiao)參數均受到處(chu)理的顯(xian)著影響（圖(tu)(tu)2b、c、d、e）。VFA比(bi)(bi)例和(he)濃(nong)度(du)(du)與(yu)(yu)BHBA和(he)GLU濃(nong)度(du)(du)相(xiang)(xiang)關（圖(tu)(tu)2f）。丙酸鹽濃(nong)度(du)(du)與(yu)(yu)BHBA濃(nong)度(du)(du)呈負相(xiang)(xiang)關且相(xiang)(xiang)關性最(zui)大（圖(tu)(tu)2g）。
圖2 CON和KET奶牛圍(wei)產期瘤胃微生物發酵和能量代謝的變化及相關性
2、酮病奶牛瘤(liu)胃細(xi)菌(jun)的特殊(shu)轉移途徑
通過(guo)16S rRNA測序探(tan)究瘤(liu)胃細(xi)(xi)菌(jun)譜的(de)時間(jian)變(bian)化。與(yu)CON組(zu)相(xiang)比(bi)，KET組(zu)在第(di)(di)7、14和(he)(he)21天有(you)較高Shannon指(zhi)數，第(di)(di)7和(he)(he)21天有(you)較高Chao 1指(zhi)數（圖(tu)3a）。β多樣性分(fen)析(xi)表(biao)明，KET組(zu)與(yu)CON組(zu)存在顯著差(cha)(cha)異(yi)，且隨時間(jian)推移(yi)差(cha)(cha)異(yi)增大(da)（圖(tu)3b）。其(qi)中(zhong)(zhong)，KET組(zu)從第(di)(di)-21-1天和(he)(he)第(di)(di)1-3天的(de)差(cha)(cha)異(yi)高于(yu)CON組(zu)（圖(tu)3c）。通過(guo)DMM分(fen)析(xi)識別(bie)圍產期細(xi)(xi)菌(jun)組(zu)成的(de)變(bian)化，確定了11個DMM簇。在KET和(he)(he)CON組(zu)中(zhong)(zhong)，產犢前聚類5和(he)(he)6均占優勢（圖(tu)3f、g）。
圖3 KET與(yu)CON奶牛瘤胃細菌多(duo)樣性(xing)及組成的變化(hua)規律
3、瘤胃微生物組成(cheng)的(de)動態變化
AQ-PCR和(he)宏基因組學表明，僅細菌(jun)(jun)的(de)(de)拷(kao)貝數(shu)受到處理和(he)相互作用的(de)(de)顯著(zhu)(zhu)影響（圖4a）。宏基因組學計算的(de)(de)微生(sheng)物比例顯示，單個微生(sheng)物的(de)(de)比例沒有顯著(zhu)(zhu)差異（圖4b）。但在第(di)7天KET組中細菌(jun)(jun)Chao1指數(shu)高于CON組，在第(di)14天，古菌(jun)(jun)的(de)(de)Shannon指數(shu)高于CON組（圖4c）。
圖4 圍產期KET和CON奶牛瘤胃微生(sheng)物譜(pu)的動態(tai)變化
4、酮病奶牛氨基酸和碳水化合(he)物代(dai)謝的微生物學功能下降
宏基因組(zu)結果表明(ming)(ming)在第3、7和14天，兩組(zu)之間的(de)微生物群(qun)顯著不同，而微生物群(qun)功(gong)能僅在第3天改(gai)變（圖5a）篩選不同組(zu)中(zhong)(zhong)富集的(de)功(gong)能，從第3-14天，瘤胃(wei)微生物群(qun)顯著不同功(gong)能的(de)數量減(jian)少（圖5b）。并在三個時(shi)間點之間沒有發(fa)現(xian)共同的(de)顯著不同的(de)途徑（圖5c）。差(cha)異分析表明(ming)(ming)CON組(zu)中(zhong)(zhong)主要富集為(wei)有碳水化合物代(dai)謝(xie)和氨基酸代(dai)謝(xie)途徑（圖5f）。
圖(tu)5 KET和(he)CON奶(nai)牛(niu)產后(hou)瘤(liu)胃微生(sheng)物功能的動態(tai)變化
5、酮病(bing)奶牛瘤胃(wei)內生糖氨(an)基酸及其代謝途徑下調
代(dai)謝(xie)(xie)組(zu)分析表明，CON組(zu)中蛋白(bai)質消化和吸收以及氨(an)(an)基酸(suan)(suan)代(dai)謝(xie)(xie)途徑在(zai)第(di)3天上調(diao)（圖(tu)6 b），甘油磷脂代(dai)謝(xie)(xie)、淀粉和蔗(zhe)糖代(dai)謝(xie)(xie)等在(zai)第(di)3天顯(xian)著，抗葉酸(suan)(suan)劑抗性在(zai)第(di)7天顯(xian)著（圖(tu)6d）。KET組(zu)中瘤胃(wei)(wei)微生(sheng)物(wu)代(dai)謝(xie)(xie)途徑中精(jing)氨(an)(an)酸(suan)(suan)生(sheng)物(wu)合成、苯丙氨(an)(an)酸(suan)(suan)、酪氨(an)(an)酸(suan)(suan)等在(zai)第(di)3天顯(xian)著下調(diao)。并且(qie)KET組(zu)的生(sheng)糖氨(an)(an)基酸(suan)(suan)瘤胃(wei)(wei)濃度在(zai)第(di)3天顯(xian)著降低（圖(tu)6d）。
圖6 KET奶牛瘤(liu)胃中的生糖(tang)氨基酸及其代謝途(tu)徑下調
6、酮病(bing)奶牛(niu)瘤(liu)胃丙酸發酵途(tu)徑下(xia)調
碳水化(hua)合(he)物(wu)(wu)代(dai)謝(xie)途徑(jing)(jing)在KET組中下調，膳食攝入后，飼料中的(de)纖(xian)維(wei)素、半(ban)纖(xian)維(wei)素、果膠(jiao)和(he)淀粉被瘤(liu)胃(wei)微(wei)生物(wu)(wu)降解（圖(tu)7a）。通過單個丙酸(suan)子途徑(jing)(jing)的(de)基因的(de)百(bai)分比，表明在所有瘤(liu)胃(wei)液樣品中，氨基酸(suan)分解代(dai)謝(xie)、發(fa)酵和(he)生物(wu)(wu)合(he)成(cheng)途徑(jing)(jing)的(de)平均(jun)豐(feng)度(du)分別占(zhan)總豐(feng)度(du)的(de)57.25%、33.78%和(he)8.97%（圖(tu)7b）。通過基因和(he)代(dai)謝(xie)物(wu)(wu)倍數變化(hua)以(yi)表征(zheng)參與丙酸(suan)代(dai)謝(xie)途徑(jing)(jing)的(de)代(dai)謝(xie)物(wu)(wu)和(he)酶動態變化(hua)（圖(tu)7c）。
圖(tu)7 KET奶牛瘤(liu)胃碳(tan)水化合物代(dai)(dai)謝(xie)中丙酸代(dai)(dai)謝(xie)下調(diao)
7、瘤胃微生物區系(xi)通(tong)過減少生糖氨基酸(suan)和丙(bing)酸(suan)鹽的供應而導(dao)致酮病
普(pu)雷(lei)沃(wo)氏菌屬(shu)、瘤胃球菌屬(shu)、UBA 1066屬(shu)等7種菌的豐度在第3、7和14天中(zhong)的某一天顯(xian)著降低，并對氨(an)基酸(suan)(suan)和丙酸(suan)(suan)代謝均有(you)貢獻（圖8a）。相關(guan)性(xing)分(fen)析也顯(xian)示這些屬(shu)之間呈正(zheng)相關(guan)性(xing)（圖8b）。MEM顯(xian)示，普(pu)雷(lei)沃(wo)氏菌、UBA 1066、Chao 1和shannon指數等自變(bian)(bian)(bian)量(liang)與丙酸(suan)(suan)鹽、精氨(an)酸(suan)(suan)和甘氨(an)酸(suan)(suan)等介(jie)導變(bian)(bian)(bian)量(liang)相關(guan)，這些介(jie)導變(bian)(bian)(bian)量(liang)最終與BHBA和GLU濃度相關(guan)并有(you)直接(jie)影響(xiang)（圖8c）。根(gen)據(ju)MEM條(tiao)件，建立的10個(ge)介(jie)導效(xiao)應中(zhong)6個(ge)為完全介(jie)導效(xiao)應（圖8d）。
圖(tu)8中介效應(ying)模型揭示瘤胃微生(sheng)物群的種類和多樣性通(tong)過減(jian)少生(sheng)糖底(di)物的供應(ying)來調節血清BHBA和GLU濃度
8、丙(bing)酸鈉飼喂酮病奶(nai)牛以驗證瘤胃微生物群及其(qi)代謝(xie)產物在酮病發(fa)生中的(de)作(zuo)用
產犢后第7天(tian)過濾酮病奶(nai)牛(niu)，并從(cong)第7天(tian)至(zhi)第14天(tian)飼喂丙酸(suan)鈉（SP）（圖(tu)9a）。BHBA和GLU濃度受到時間(jian)和SP處理(li)互作(zuo)用的影響(xiang)（圖(tu)9b和c）。時間(jian)與(yu)SP的丙酸(suan)鹽濃度和比例(li)、總VFA濃度、A-P比間(jian)存在相(xiang)互作(zuo)用（圖(tu)9d）。
圖9 丙酸鈉對KET奶牛血液BHBA和GLU濃度及瘤胃發酵參(can)數的影響
研(yan)究結論
該研究(jiu)是第一個(ge)縱向評估圍(wei)產期碳水化合(he)物(wu)和脂質(zhi)代謝(xie)(xie)紊亂奶牛(niu)瘤(liu)(liu)胃微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)的研究(jiu)。研究(jiu)證明奶牛(niu)產犢(du)后表現(xian)出瘤(liu)(liu)胃微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)破壞，與(yu)改(gai)變參與(yu)丙酸(suan)鹽(yan)和生(sheng)(sheng)糖氨基(ji)酸(suan)代謝(xie)(xie)的微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)基(ji)因有關，研究(jiu)結果對(dui)瘤(liu)(liu)胃微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)動(dong)態與(yu)宿主能量(liang)代謝(xie)(xie)的關系具有重(zhong)要(yao)意義(yi)，通過調節(jie)瘤(liu)(liu)胃微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)或提供特殊的生(sheng)(sheng)糖前體為預防酮病(bing)的潛在策(ce)略。
原文(wen)引(yin)用：Fanlin Kong, Shuo Wang, Yijia Zhang, Chen Li, Dongwen Dai, Cheng Guo, Yajing Wang, Zhijun Cao,Hongjian Yang, Yanliang Bi, Wei Wang and Shengli Li1. Rumen microbiome associates with postpartum ketosis development in dairy cows: a prospective nested case–control study. Microbiome 13.1 (2025): 69.
原文鏈接：DOI: 10.1186/s40168-025-02072-3
