2025年5月7日，上海交通大學生命科學技術學院唐鴻志團隊與中國科學院戴俊彪團隊合作，在《Nature》正刊發表環(huan)境微生(sheng)物(wu)技術新文章！

該篇利用合(he)成生(sheng)物學(xue)方法，對需鈉弧菌進行基因工程改造，開發了高效自然轉(zhuan)化方法和基因組迭代編輯技術(shu)INTIMATE。該技(ji)術(shu)構建的需鈉(na)弧菌工程菌株能(neng)在高鹽工業(ye)廢(fei)水(shui)和高鹽土壤中同時(shi)降(jiang)解多種(zhong)有(you)機污染物，為解決石化廢(fei)水(shui)排污、海洋石油泄漏等全球性環境問(wen)題提供了全新的技(ji)術(shu)方(fang)案。

01、研究(jiu)背景

工業廢水、石油泄漏和塑料污染對海洋生態安全和人類健康構成嚴重威脅，其中單環芳烴（MAHs）、多環芳烴（PAHs）等有機污染物具有毒性強、難降解的特點，盡管已有研究表明這些有機污染物可以被微生物降解，但這些細菌通常不能處理復雜的有機污染物，然而近年來飛速發展的合成生物學技術為降解菌株的構建提供了可能。需(xu)鈉弧菌（Vibrio natriegens Vmax）是一(yi)種有(you)前景(jing)的底盤物(wu)種，作為增(zeng)長最(zui)快的已(yi)知細菌，具有(you)耐鹽性強(qiang)、碳源(yuan)利用廣等優勢，已(yi)被廣泛用于合成生物(wu)學。本(ben)研(yan)究開(kai)發(fa)了一(yi)種基因組(zu)工程方(fang)法(fa)（基于Vmax的迭(die)代自然轉(zhuan)(zhuan)化(hua)和放(fang)大(da)tfoX效(xiao)應）將(jiang)5個基因簇（共43 kb）轉(zhuan)(zhuan)移到Vmax中，構建能(neng)夠修復(fu)涵蓋(gai)氯堿廠(chang)和煉油廠(chang)工業廢(fei)水樣(yang)品中的廣泛污染物(wu)（從單環(huan)(huan)苯(ben)到雙環(huan)(huan)和多環(huan)(huan)化(hua)合物(wu)）的工程菌株VCOD-15，并評(ping)估(gu)了其修復(fu)能(neng)力(li)。

復合(he)有機污染降(jiang)解(jie)菌株VCOD-15設計和(he)構建流程示意圖

本(ben)研(yan)究(jiu)(jiu)涉及轉錄(lu)(lu)組(zu)(zu)(zu)、微生物組(zu)(zu)(zu)、基因組(zu)(zu)(zu)、代(dai)謝(xie)組(zu)(zu)(zu)等組(zu)(zu)(zu)學，派(pai)森(sen)諾提(ti)供了(le)微生物組(zu)(zu)(zu)+轉錄(lu)(lu)組(zu)(zu)(zu)測序及部分分析服務，具體研(yan)究(jiu)(jiu)方案(an)如下：

02、研究(jiu)結果

1、底盤菌株(zhu)篩選與(yu)耐鹽機制解析

對(dui)多(duo)種污染物(wu)降(jiang)解底盤細(xi)胞進行對(dui)比(bi)，發(fa)(fa)現(xian)需鈉(na)弧菌（Vibrio natriegens Vmax）在(zai)30.0 g/L至50.0 g/L鹽濃度（LB3、LB5 培養基(ji)）下可表現(xian)出更高(gao)的(de)生物(wu)量和污染物(wu)耐(nai)受性(xing)（Fig.1b+Fig2a）。對(dui)有無(wu)復雜污染物(wu)壓力(li)(li)下Vmax菌的(de)轉(zhuan)錄組進行分析，發(fa)(fa)現(xian)其外(wai)排(pai)泵基(ji)因(yin)（marA、acrAB-tolC）及 ABC 轉(zhuan)運(yun)蛋(dan)白基(ji)因(yin)轉(zhuan)錄顯著上(shang)調，增強了對(dui)有毒(du)物(wu)質的(de)排(pai)出能力(li)(li)。

Fig.1b：需(xu)鈉(na)弧菌與三種模(mo)式菌株不同培養基培養的生(sheng)物量(liang)對比

Fig.2a：在(zai)含有污染物的LB1/4、LB、LB3和(he)LB5培養基中，候選菌株的生長速率比較

擴展數據Fig1：復雜有(you)機污染物存(cun)在和不(bu)存(cun)在時(shi)Vmax的(de)比較轉錄(lu)組分析

2、增加自然轉化率得到(dao)優(you)化菌(jun)株VCOD-2

通過分(fen)析不同啟動(dong)子功能(neng)，確定組成型啟動(dong)子 P(25) 和誘導(dao)型啟動(dong)子 P(T7) 為高(gao)效表(biao)達(da)元件，為后續外(wai)(wai)(wai)源(yuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)導(dao)入奠定基(ji)(ji)(ji)礎（詳(xiang)細見補(bu)充數據Fig.6）。V. natriegens擁有與(yu)自(zi)然轉(zhuan)化相關(guan)的(de)(de)(de)(de)潛在基(ji)(ji)(ji)因(yin)，其表(biao)達(da)由全局轉(zhuan)錄因(yin)子tfoX15增強(qiang)。這種表(biao)達(da)促(cu)進了外(wai)(wai)(wai)源(yuan)轉(zhuan)化DNA的(de)(de)(de)(de)攝取，并(bing)隨后整(zheng)合(he)(he)到基(ji)(ji)(ji)因(yin)組中（詳(xiang)細見補(bu)充數據Fig.7）。因(yin)此，研(yan)究人員將來自(zi)霍亂弧菌(jun)的(de)(de)(de)(de)自(zi)然轉(zhuan)化調控基(ji)(ji)(ji)因(yin)tfoX整(zheng)合(he)(he)到 Vmax 的(de)(de)(de)(de)染色體(ti)上(shang)，構建菌(jun)株(zhu)VCOD-2。測試(shi)表(biao)明(ming)VCOD-2可(ke)高(gao)效整(zheng)合(he)(he)外(wai)(wai)(wai)源(yuan)DNA片段(duan)（即使低至 0.5 ng）到細菌(jun)基(ji)(ji)(ji)因(yin)組，轉(zhuan)化效率(lv)(lv)可(ke)提升數倍。同時，線(xian)性 DNA 片段(duan)（> 1kb）的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)化效率(lv)(lv)可(ke)提升 3-5 倍，且無抗(kang)性標記殘留，降低了抗(kang)性基(ji)(ji)(ji)因(yin)隨水平基(ji)(ji)(ji)因(yin)轉(zhuan)移發(fa)生(sheng)環境泄露的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物風險，減少了工程菌(jun)株(zhu)改造中對抗(kang)性標記的(de)(de)(de)(de)依賴性，且生(sheng)長速率(lv)(lv)并(bing)未減少（Fig2(b-f)）。

3、插入位點的選擇

通過(guo)(guo)基因(yin)(yin)(yin)組分析，在(zai)Vmax 染色體上鑒(jian)定(ding)了 12 個中性(xing)基因(yin)(yin)(yin)組位點，作為候選基因(yin)(yin)(yin)簇的(de)插入(ru)位點。其中，chr2_297 位點表現出(chu)最(zui)優的(de)基因(yin)(yin)(yin)整(zheng)(zheng)合特(te)性(xing)，可(ke)穩定(ding)整(zheng)(zheng)合基因(yin)(yin)(yin)簇，且整(zheng)(zheng)合過(guo)(guo)程未對宿主菌的(de)正常生長造成顯著影響，為后續多基因(yin)(yin)(yin)簇的(de)高效串(chuan)聯整(zheng)(zheng)合提供(gong)了理想的(de)基因(yin)(yin)(yin)組平臺（Fig2(g-i)）。

Fig 2b-i：tfoX基因整合位(wei)(wei)點及線性 DNA 片段的轉化效率，基因組(zu)插入候(hou)選位(wei)(wei)點及最優基因整合位(wei)(wei)點測(ce)試

4、人(ren)工降解(jie)基因簇(cu)的設計、合成(cheng)及(ji)驗證

人工(gong)挖掘并(bing)設計了(le)多(duo)條化合物(wu)降(jiang)解(jie)基因(yin)簇，通過基因(yin)合成與組裝技術，利用釀(niang)酒酵(jiao)母進(jin)行(xing)基因(yin)簇的(de)組裝，并(bing)將9個基因(yin)簇分(fen)別(bie)整合到chr2_297位點，構建了(le)VCOD-3至VCOD-11系列包含單條降(jiang)解(jie)基因(yin)簇的(de)工(gong)程菌(jun)株(zhu)(zhu)。模擬(ni)污(wu)(wu)染(ran)物(wu)環境(jing)進(jin)行(xing)工(gong)程菌(jun)株(zhu)(zhu)的(de)降(jiang)解(jie)功能測試，降(jiang)解(jie)率和代謝組結果表明，VCOD-3、VCOD-4、VCOD-5、VCOD-6和VCOD-7工(gong)程菌(jun)有(you)降(jiang)解(jie)能力(li)，并(bing)且不會(hui)對(dui)生長速率產生不利影響。 四種(zhong)工(gong)程菌(jun)株(zhu)(zhu)，包括(kuo)VCOD-8、VCOD-9、VCOD-10和VCOD-11，沒有(you)表現出減少相應污(wu)(wu)染(ran)物(wu)的(de)能力(li)，且5個菌(jun)株(zhu)(zhu)聯(lian)合體也可以(yi)對(dui)復雜污(wu)(wu)染(ran)物(wu)進(jin)行(xing)修復。因(yin)此，選擇了(le)針對(dui)聯(lian)苯(ben)(ben)（bphA(1234)BCDHIJK）、苯(ben)(ben)酚（dmpLMNOP）、萘（nahA(abcd)BCDEF）、二苯(ben)(ben)并(bing)呋喃（dbfA(1234)BC）和甲苯(ben)(ben)（xylMNABC）的(de)降(jiang)解(jie)基因(yin)簇為候選，并(bing)確(que)保其在需鈉弧(hu)菌(jun)中的(de)高效表達（Fig.3）。

Fig.3：VCOD-3至VCOD-11系列單(dan)降解基因簇工(gong)程菌株及降解功能測試

5、復雜有機(ji)污染物生物修復

為(wei)了(le)(le)(le)獲得可以(yi)包含5個(ge)降(jiang)(jiang)解(jie)(jie)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)簇(cu)的(de)(de)單一菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)用(yong)來同時處理5種有(you)機污染物，研究(jiu)人員進(jin)行了(le)(le)(le)迭(die)代(dai)(dai)自然(ran)轉化法(fa)（INTIMATE）技術的(de)(de)開發。以(yi)VCOD-3為(wei)初始菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)，利用(yong)酵母(mu)體(ti)內組裝技術，實現了(le)(le)(le)多(duo)(duo)(duo)個(ge)降(jiang)(jiang)解(jie)(jie)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)簇(cu)（覆蓋單環(huan)(huan)到多(duo)(duo)(duo)環(huan)(huan)、雜(za)環(huan)(huan)有(you)機污染物）的(de)(de)構建(jian)。進(jin)而利用(yong)同源替(ti)換策略(lve)，迭(die)代(dai)(dai)整合(he)了(le)(le)(le)5個(ge)功(gong)能(neng)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)簇(cu)（總(zong)長度 43 kb）到細菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組中(zhong)(zhong)，構建(jian)了(le)(le)(le)多(duo)(duo)(duo)功(gong)能(neng)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)VCOD-15。對(dui)每(mei)輪編輯的(de)(de)中(zhong)(zhong)間菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)（VCOD-12、VCOD-13和VCOD-14）及VCOD-15的(de)(de)修復(fu)功(gong)能(neng)驗證，結果表(biao)(biao)明(ming)(ming)，每(mei)輪中(zhong)(zhong)間菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)和最后(hou)VCOD-15菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)都具有(you)較(jiao)好的(de)(de)修復(fu)功(gong)能(neng)，尤其VCOD-15工(gong)程菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)在 48 h內對(dui)5種目標污染物的(de)(de)去(qu)除(chu)率均超 60%，其中(zhong)(zhong)聯(lian)苯降(jiang)(jiang)解(jie)(jie)率達100%，甲苯、二苯并(bing)呋喃降(jiang)(jiang)解(jie)(jie)率近 90%，顯著(zhu)優于天(tian)然(ran)降(jiang)(jiang)解(jie)(jie)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)（Fig.4）。此(ci)外，生長速(su)率和sanger測序表(biao)(biao)明(ming)(ming)，插入基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)簇(cu)對(dui)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)生長無影(ying)響(xiang)，且(qie)穩定存在基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組中(zhong)(zhong)，這些發現表(biao)(biao)明(ming)(ming)，構建(jian)的(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)具有(you)遺(yi)傳穩定性(xing)(詳細見補(bu)充數(shu)據)。

Fig4：VCOD-15對復雜有機污染物的修復及(ji)基因(yin)表達水平的研(yan)究

6、廢水中的污染物(wu)治(zhi)理

對Vmax菌(jun)(jun)和(he)其(qi)他(ta)對照菌(jun)(jun)株(zhu)在(zai)高鹽(yan)環境中的適應(ying)(ying)性(xing)(xing)進(jin)行研究，結果(guo)表(biao)明，在(zai)鹽(yan)度(du)高達 102.5 g/L的氯(lv)堿工業(ye)廢(fei)水（BZI）和(he)52.5 g/L的石油煉化廢(fei)水（DLI）中，對照菌(jun)(jun)株(zhu)無法生(sheng)長，而Vmax仍保持活性(xing)(xing)，體現了其(qi)獨特的耐(nai)鹽(yan)優勢。在(zai)活性(xing)(xing)污(wu)泥反應(ying)(ying)器中，12 h內(nei)VCOD-15菌(jun)(jun)株(zhu)可完全去除高濃度(du)污(wu)染物(wu)（1.0 mM 聯苯(ben)、1.5 mM 苯(ben)酚(fen)等）；多平行生(sheng)物(wu)反應(ying)(ying)器測試顯示，48 h內(nei)工業(ye)廢(fei)水中污(wu)染物(wu)殘(can)留量(liang)均低于檢(jian)測限(xian)的 2%，且通(tong)過16s多樣性(xing)(xing)測序分析發現VCOD-15菌(jun)(jun)株(zhu)在(zai)復雜(za)微生(sheng)物(wu)群落中具有占比穩(wen)定（Fig.5和(he)擴(kuo)展(zhan)數據Fig.10）。

Fig.5:VCOD-15在活性污(wu)泥(ni)生物反(fan)應(ying)器中對(dui)復雜污(wu)染工(gong)業廢(fei)水樣品的(de)生物修復

擴展數據Fig.10:多并(bing)行生(sheng)物反應器(qi)中(zhong)工業廢水(shui)樣品的生(sheng)物修復(fu)

7、土壤中的(de)污(wu)染物降解(jie)能力驗證(zheng)

為了評(ping)估VCOD-15在土(tu)壤中的(de)修復(fu)潛力(li)，使用混合了聯(lian)苯(ben)基（0.77 mmol）的(de)土(tu)壤進(jin)行(xing)(xing)了生(sheng)物修復(fu)實驗?。結果(guo)(guo)表明，在含鹽土(tu)壤中，8天(tian)內聯(lian)苯(ben)、苯(ben)酚(fen)、萘、二苯(ben)并呋喃的(de)凈降解量(liang)分(fen)別(bie)達 0.16、0.66、0.21、0.03 mmol/kg，同位素標記實驗證(zheng)實了污(wu)染物被(bei)有效的(de)進(jin)行(xing)(xing)了降解（詳細結果(guo)(guo)見補充數據Fig.16+17）。

03、研(yan)究結論

本(ben)(ben)研究成(cheng)(cheng)功開發了(le)基于需鈉(na)弧菌(jun)的(de)(de)復合(he)(he)(he)(he)污染物工程(cheng)(cheng)(cheng)菌(jun)構(gou)(gou)(gou)(gou)建(jian)平(ping)臺，實現了(le)從代(dai)謝通路的(de)(de)挖掘、設計和(he)合(he)(he)(he)(he)成(cheng)(cheng)到單一、復合(he)(he)(he)(he)污染物降解(jie)菌(jun)株的(de)(de)構(gou)(gou)(gou)(gou)建(jian)、測(ce)試、以及(ji)在(zai)實際工業廢水(shui)樣(yang)本(ben)(ben)處理應用(yong)的(de)(de)全(quan)流程(cheng)(cheng)(cheng)，為石化(hua)、氯(lv)堿等高鹽(yan)廢水(shui)處理、海上(shang)石油(you)泄漏、微塑料污染等全(quan)球性挑戰提供了(le)生(sheng)物解(jie)決(jue)方案。同(tong)(tong)時，INTIMATE技術(shu)為多(duo)基因簇工程(cheng)(cheng)(cheng)底盤的(de)(de)構(gou)(gou)(gou)(gou)建(jian)提供了(le)通用(yong)技術(shu)平(ping)臺，使得同(tong)(tong)一菌(jun)株中(zhong)多(duo)種(zhong)代(dai)謝功能的(de)(de)整合(he)(he)(he)(he)以及(ji)優質菌(jun)種(zhong)的(de)(de)迭代(dai)功能拓展(zhan)(zhan)成(cheng)(cheng)為可能，可擴展(zhan)(zhan)至(zhi)其他污染物降解(jie)體(ti)系的(de)(de)構(gou)(gou)(gou)(gou)建(jian)乃至(zhi)天然(ran)產物合(he)(he)(he)(he)成(cheng)(cheng)、高值化(hua)學(xue)品細(xi)胞工程(cheng)(cheng)(cheng)構(gou)(gou)(gou)(gou)建(jian)等合(he)(he)(he)(he)成(cheng)(cheng)生(sheng)物學(xue)應用(yong)場景。

原文引用(yong)：Su, C., Cui, H., Wang, W. et al. Bioremediation of complex organic pollutants by engineered Vibrio natriegens. Nature (2025). //doi.org/10.1038/s41586-025-08947-7.

原文鏈(lian)接：//www.nature.com/articles/s41586-025-08947-7