2025-08-04
近日，西南林(lin)業大(da)學(xue)在微生物學領域的《Journal of Fungi》發(fa)表(biao)(biao)新研(yan)(yan)究成(cheng)(cheng)果！本研(yan)(yan)究通過(guo)基(ji)因組(zu)(zu)(zu)學、代(dai)(dai)(dai)謝(xie)組(zu)(zu)(zu)學和(he)轉錄組(zu)(zu)(zu)學分(fen)析(xi)，系(xi)統揭示了(le)不同栽培條件下(xia)暗(an)褐網(wang)(wang)柄牛(niu)肝菌（Phlebopus portentosus）次級(ji)代(dai)(dai)(dai)謝(xie)產物的合成(cheng)(cheng)機制(zhi)。研(yan)(yan)究團隊成(cheng)(cheng)功組(zu)(zu)(zu)裝了(le)31.4 Mb的基(ji)因組(zu)(zu)(zu)， 鑒定出多個次級(ji)代(dai)(dai)(dai)謝(xie)產物相關的關鍵功能基(ji)因。通過(guo)共表(biao)(biao)達網(wang)(wang)絡分(fen)析(xi)進一步揭示了(le)PpHOX4、PpHSF1等轉錄因子對代(dai)(dai)(dai)謝(xie)途(tu)徑的調控作用。該研(yan)(yan)究為開發(fa)利用這(zhe)一珍(zhen)稀食藥(yao)用菌的活性成(cheng)(cheng)分(fen)提供了(le)重要的分(fen)子基(ji)礎。
本研(yan)究中真菌denovo測序(xu)和分(fen)析工作(zuo)由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
暗褐網柄牛肝(gan)菌(jun)(jun)（P. portentosus）是一(yi)種(zhong)具有重要食(shi)藥(yao)用價值的(de)外生(sheng)(sheng)菌(jun)(jun)根真菌(jun)(jun)，富含蛋白質、多(duo)糖等多(duo)種(zhong)活(huo)性(xing)成(cheng)分(fen)。作為云南等地特(te)有的(de)"黑牛肝(gan)菌(jun)(jun)"，其野生(sheng)(sheng)資源因過度采挖而銳減，現已成(cheng)為首個實現人(ren)工栽培的(de)牛肝(gan)菌(jun)(jun)種(zhong)。研究表明，該菌(jun)(jun)能產(chan)生(sheng)(sheng)降血(xue)糖、抗腫(zhong)瘤等多(duo)種(zhong)活(huo)性(xing)代謝產(chan)物(wu)，但關(guan)于該菌(jun)(jun)聚酮化合物(wu)和萜類(lei)物(wu)質生(sheng)(sheng)物(wu)合成(cheng)途(tu)徑(jing)的(de)研究仍屬空白，特(te)別是栽培條件對其次級代謝產(chan)物(wu)影響的(de)多(duo)組學整合分(fen)析(xi)尚未見報道(dao)。
研究材料與方法
1、實驗材(cai)料
P. portentosus YAF023菌株
2、測序平臺(tai)
illumina Novaseq+Nanopore
3、分析內容
真菌(jun)基因組近完成圖測序(xu)、轉錄組測序(xu)、代謝組分析、次級代謝產物基因簇分析、qPCR驗(yan)證
研究結果(guo)
基(ji)因組(zu)特征
基(ji)因(yin)組測序(xu)獲得31.42 Mb序(xu)列（GC含量48.91%），包(bao)含15個(ge)(ge)scaffolds（N50=2.64 Mb），預測得到(dao)7,928個(ge)(ge)蛋白(bai)編(bian)碼基(ji)因(yin)。功能注釋顯示與近緣(yuan)種Phlebopus sp. FC_14同源度達84.09%，鑒定出206個(ge)(ge)細胞色素P450、201個(ge)(ge)碳水化合物(wu)活(huo)性酶(mei)（包(bao)括89個(ge)(ge)糖苷水解(jie)酶(mei)和53個(ge)(ge)糖基(ji)轉移酶(mei)）等(deng)關(guan)鍵功能基(ji)因(yin)。特別值(zhi)得注意的(de)是，該菌(jun)含有15個(ge)(ge)漆(qi)酶(mei)基(ji)因(yin)和1個(ge)(ge)過氧化物(wu)酶(mei)基(ji)因(yin)，表明具有木質素降解(jie)潛力，但僅鑒定到(dao)7個(ge)(ge)纖維素酶(mei)基(ji)因(yin)，提(ti)示其纖維素降解(jie)能力較(jiao)弱。
圖1 基因組特征
毒力(li)因(yin)子分析發現837個(ge)相(xiang)關基因(yin)，主(zhu)要涉及效應分泌系(xi)統(tong)（236）、營養代(dai)謝(xie)因(yin)子（190）和(he)免疫調節(jie)（154），而PHI分析顯示"毒力(li)減弱"基因(yin)占(zhan)比最(zui)高（1,431個(ge)），表明(ming)該菌致病性較低。共(gong)鑒(jian)定出206個(ge)CYP450基因(yin)，分屬(shu)30個(ge)超家族，其(qi)(qi)中(zhong)CYP620超家族基因(yin)數量最(zui)多（64個(ge)），其(qi)(qi)次為CYP51（50個(ge)）、CYP81（12個(ge)）和(he)CYP83（12個(ge)）。
圖(tu)2 PHI和P450注釋(shi)
代謝組學和(he)轉錄組學特征分析
通過LC-MS技術分(fen)(fen)析(xi)(xi)了暗褐(he)網柄牛肝菌在(zai)不同培養(yang)條(tiao)件下的代(dai)(dai)謝(xie)特征，共鑒定到1582種代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)(wu)，主要包括有機(ji)酸(suan)、脂質(zhi)、生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)堿等(deng)類別。PCA分(fen)(fen)析(xi)(xi)顯(xian)示各組(zu)代(dai)(dai)謝(xie)譜(pu)差異顯(xian)著(zhu)，其中L016與L016_BWS組(zu)存(cun)在(zai)651個(ge)(ge)差異代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)(wu)。KEGG分(fen)(fen)析(xi)(xi)表明(ming)這些差異代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)(wu)顯(xian)著(zhu)富(fu)集(ji)(ji)于ABC轉(zhuan)運蛋(dan)白、氨(an)基(ji)酸(suan)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)合成等(deng)20條(tiao)代(dai)(dai)謝(xie)通路。轉(zhuan)錄(lu)組(zu)分(fen)(fen)析(xi)(xi)顯(xian)示，L016_PDA、L016和(he)(he)L016_BWS組(zu)的有效(xiao)數據占(zhan)比(bi)分(fen)(fen)別為(wei)98.87%、98.96%和(he)(he)98.82%，比(bi)對率分(fen)(fen)別為(wei)96.96%、95.35%和(he)(he)96.24%。差異基(ji)因(yin)分(fen)(fen)析(xi)(xi)發現，L016_PDA vs L016組(zu)存(cun)在(zai)431個(ge)(ge)DEGs（上(shang)(shang)調(diao)232個(ge)(ge)），L016 vs L016_BWS組(zu)存(cun)在(zai)410個(ge)(ge)DEGs（上(shang)(shang)調(diao)64個(ge)(ge)）。這些差異基(ji)因(yin)主要富(fu)集(ji)(ji)于黃曲霉毒(du)素合成、氨(an)基(ji)酸(suan)代(dai)(dai)謝(xie)、核(he)糖(tang)體(ti)等(deng)通路，并在(zai)解旋酶(mei)活性、核(he)糖(tang)體(ti)組(zu)成等(deng)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)學過程中富(fu)集(ji)(ji)。
圖3 轉錄組測序結果
次級代謝產(chan)物(wu)基因簇分析(xi)
通(tong)過antiSMASH數據庫分析，在P. portentosus基(ji)因(yin)組中鑒定出24個(ge)次級(ji)代謝產物合成(cheng)(cheng)基(ji)因(yin)簇，包(bao)括(kuo)18個(ge)萜烯(xi)合成(cheng)(cheng)酶（TPS）、1個(ge)非核(he)糖體肽合成(cheng)(cheng)酶（NRPS）和5個(ge)聚酮合酶（PKS）基(ji)因(yin)簇。其中，非還原(yuan)(yuan)型(xing)PKS基(ji)因(yin)PpPKS1參與苔色酸(suan)(suan)(suan)乙酯合成(cheng)(cheng)，在添加丙戊酸(suan)(suan)(suan)的(de)培養條件(jian)下表達量顯著提升；部分還原(yuan)(yuan)型(xing)PKS基(ji)因(yin)PpPKS2可能參與6-甲(jia)基(ji)水楊(yang)酸(suan)(suan)(suan)合成(cheng)(cheng)；雜(za)合型(xing)PKS-NRPS基(ji)因(yin)PpPKS5則與細(xi)胞(bao)松弛素Z5的(de)生物合成(cheng)(cheng)相關(guan)。
圖4 次級代謝產物基(ji)因簇分析
在(zai)P. portentosus中(zhong)(zhong)鑒定出(chu)18個萜烯合(he)(he)成(cheng)(cheng)酶（TPS）基(ji)因(yin)，包(bao)括6個TRI5、8個STCs以(yi)及PPS、Ptase、SQS和(he)SQCY各1個。系統發育分析顯(xian)示，PpTRI5與球孢白僵(jiang)菌等(deng)(deng)菌株的TRI5蛋白聚類，負責合(he)(he)成(cheng)(cheng)四環倍半萜β-型毛二烯；PpSTCs可能參與β-柯巴烯等(deng)(deng)衍生物的合(he)(he)成(cheng)(cheng)。轉(zhuan)錄組分析表明，不(bu)同培養(yang)條(tiao)件(jian)下TPS基(ji)因(yin)表達(da)差異顯(xian)著：PpTRI5和(he)PpSTCs1/5/7在(zai)添加丙戊酸的液體培養(yang)（L016_BWS）中(zhong)(zhong)高表達(da)，而PpSTCs3/6/8在(zai)固(gu)體培養(yang)（L016_PDA）中(zhong)(zhong)表達(da)更(geng)活躍。此外，通過轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)結合(he)(he)位點預測發現(xian)，PpHSF1和(he)PpHOX4可能調控(kong)PpPKS1基(ji)因(yin)表達(da)，Ppzf-C2H2 32和(he)PpHSF5則分別(bie)調控(kong)PpSTCs8和(he)PpSTCs3的表達(da)。
qPCR驗證
選取了PpPKS1/2/5、PpSTCs6/8等9個次級(ji)代謝(xie)(xie)相關基因(yin)及(ji)其調(diao)控因(yin)子進(jin)行qPCR驗證。結果(guo)顯示(shi)qPCR與RNA-seq數(shu)據高度一致，證實(shi)了轉錄組結果(guo)的可靠性。研(yan)究發現，PpPKS1/PpPKS2及(ji)其轉錄因(yin)子PpHOX4/PpTFIIB3在添(tian)加丙戊酸的液體(ti)培養(yang)中顯著上調(diao)，而PpSTCs6/PpSTCs8及(ji)其調(diao)控因(yin)子PpHSF5/PpZn-clus9則在固體(ti)培養(yang)中表達(da)優(you)勢明顯。這一發現不僅證實(shi)了培養(yang)條(tiao)件(jian)對次級(ji)代謝(xie)(xie)基因(yin)表達(da)的特異性調(diao)控作用，也(ye)為通過優(you)化培養(yang)條(tiao)件(jian)定向調(diao)控代謝(xie)(xie)物合成提(ti)供了重(zhong)要依據。
圖5 qPCR驗(yan)證結果
結論
本研究(jiu)(jiu)通(tong)過整合基因組學、代(dai)謝(xie)組學和轉錄組學技術，系統解析(xi)了P. portentosus在不同栽培條件下次級代(dai)謝(xie)產(chan)物的生(sheng)物合成(cheng)調(diao)控(kong)(kong)機(ji)制。基因組分(fen)(fen)(fen)析(xi)發(fa)(fa)現其含有206個CYP450、201個CAZymes、18個TPSs和5個PKSs等關鍵(jian)功(gong)(gong)能基因。功(gong)(gong)能解析(xi)表明：PpPKS1參與(yu)苔色(se)酸乙酯(zhi)合成(cheng)，PpPKS2/5分(fen)(fen)(fen)別(bie)調(diao)控(kong)(kong)6-甲基水楊酸和細胞松弛(chi)素Z5產(chan)生(sheng)，PpTRI5負責(ze)倍(bei)半萜合成(cheng)，PpSTCs介導β-柯巴(ba)烯衍生(sheng)物生(sheng)成(cheng)。調(diao)控(kong)(kong)網絡分(fen)(fen)(fen)析(xi)揭示PpHOX4與(yu)PpHSF1協同調(diao)控(kong)(kong)PpPKS1，而Ppzf-C2H2_32和PpHSF5分(fen)(fen)(fen)別(bie)調(diao)控(kong)(kong)PpSTCs_8/3的表達。該(gai)研究(jiu)(jiu)為食藥用真菌(jun)活性成(cheng)分(fen)(fen)(fen)開發(fa)(fa)提供了重要理論依(yi)據。
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文章索引：Kang, Z.; Yuan, X.; Zhang, C.; Wang, Y.; Li, L.; Zheng, Y. Genomic and Multi-Omics Analysis of Phlebopus portentosus: Effects of Cultivation on Secondary Metabolites. J. Fungi 2025, 11, 323. //doi.org/10.3390/jof11040323
