2017-10-25
絞(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)股藍是(shi)(shi)(shi)多年生匍(pu)匐草本植(zhi)(zhi)物，在亞洲廣(guang)(guang)泛種植(zhi)(zhi)，有(you)很多重要(yao)的(de)(de)藥(yao)用屬性。絞(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)股藍皂(zao)苷，是(shi)(shi)(shi)絞(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)股藍中(zhong)(zhong)的(de)(de)主要(yao)有(you)效成分，已被(bei)充分研(yan)究。考慮到絞(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)股藍重要(yao)的(de)(de)藥(yao)用功能，做絞(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)股藍的(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組信(xin)息(xi)研(yan)究是(shi)(shi)(shi)很有(you)必(bi)要(yao)的(de)(de)，有(you)利于(yu)開展以后(hou)的(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)調控研(yan)究。廣(guang)(guang)西醫科(ke)大學吳耀生教授團隊和(he)(he)上海派森諾合作，通過絞(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)股藍測序，總共獲(huo)得了50,654,708個unigenes。通過計算unigene的(de)(de)表達量，并將數據(ju)和(he)(he)五個常用數據(ju)庫進行(xing)比對，獲(huo)得unigenes不同方面(mian)的(de)(de)注釋信(xin)息(xi)。發(fa)現(xian)(xian)DESeq分析結(jie)果中(zhong)(zhong)FPS，SS和(he)(he)SE酶表現(xian)(xian)出不同的(de)(de)表達水(shui)平。相對于(yu)根和(he)(he)莖，葉片(pian)中(zhong)(zhong)FPS，SS和(he)(he)SE的(de)(de)表達量是(shi)(shi)(shi)高(gao)的(de)(de)。本研(yan)究通過對自然(ran)環(huan)境生長的(de)(de)絞(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)股藍進行(xing)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)學分析，發(fa)現(xian)(xian)unigene的(de)(de)表達，酶的(de)(de)表達（FPS,SS和(he)(he)SE）和(he)(he)絞(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)股藍皂(zao)苷的(de)(de)分布是(shi)(shi)(shi)一致(zhi)的(de)(de)。
絞(jiao)股(gu)藍(lan)的(de)(de)(de)主要(yao)有(you)(you)效(xiao)組成(cheng)是(shi)絞(jiao)股(gu)藍(lan)皂苷，它有(you)(you)多(duo)種多(duo)樣的(de)(de)(de)生物活性，這可(ke)(ke)以(yi)解釋絞(jiao)股(gu)藍(lan)為什么(me)會(hui)在天然藥(yao)學中(zhong)有(you)(you)廣泛應(ying)用。例如，絞(jiao)股(gu)藍(lan)皂苷可(ke)(ke)以(yi)通(tong)過增加胰島素(su)降低血糖。還有(you)(you)其他(ta)功能(neng)應(ying)用像抗癌，抗炎癥，抗焦(jiao)慮，降血脂，保護(hu)肝(gan)細胞，神經保護(hu)和(he)免疫保護(hu)等等。三帖合(he)成(cheng)途(tu)徑(jing)可(ke)(ke)以(yi)分解為三個部(bu)分：1、IPP(異(yi)戊烯(xi)基焦(jiao)磷酸)或者DMAPP（二甲基烯(xi)丙基焦(jiao)磷酸酯）合(he)成(cheng)；2、鯊烯(xi)合(he)成(cheng)和(he)環化；3、功能(neng)化反應(ying)獲得鯊烯(xi)復合(he)物（圖1）。和(he)人參(can)皂苷一(yi)樣，絞(jiao)股(gu)藍(lan)皂苷在藥(yao)學和(he)健康(kang)學中(zhong)有(you)(you)很多(duo)重要(yao)應(ying)用。但(dan)是(shi)絞(jiao)股(gu)藍(lan)皂苷和(he)人參(can)皂苷相比(bi)(bi)，有(you)(you)更高(gao)的(de)(de)(de)異(yi)質性，其中(zhong)有(you)(you)超過169種絞(jiao)股(gu)藍(lan)皂苷。絞(jiao)股(gu)藍(lan)比(bi)(bi)人參(can)中(zhong)的(de)(de)(de)三萜化合(he)物種類高(gao)出5倍(bei)。這可(ke)(ke)能(neng)和(he)三帖合(he)成(cheng)途(tu)徑(jing)中(zhong)的(de)(de)(de)基因與酶的(de)(de)(de)差(cha)異(yi)表達相關。
圖1 三(san)帖合成途(tu)徑
高通量測(ce)序(xu)獲得(de)352,999,296條原(yuan)始(shi)reads，過濾掉接頭和低質量序(xu)列，剩余249,488,643條clean reads。組裝之后(hou)得(de)到(dao)1,119,964個(ge)contigs，總(zong)長(chang)度(du)達249,488,543bp。將contigs拼接成轉錄(lu)(lu)本(ben)，得(de)到(dao)159,858,904個(ge)轉錄(lu)(lu)本(ben)序(xu)列。和NR數據(ju)庫比對后(hou)，獲得(de)50,654,708個(ge)unigene，平均長(chang)度(du)755bp。
用NR，GO，KEGG，eggNOG和Swiss-Port數(shu)據庫注釋unigenes。整體看來，eggNOG中(zhong)鑒定率高，達到96.57%，KEGG中(zhong)鑒定率低，只有(you)8.77%。
表(biao)1 unigenes 注釋結果
統計unigene的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RPKM，做RPKM的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)密(mi)度分(fen)(fen)(fen)(fen)布(bu)圖(tu)。發(fa)現中(zhong)(zhong)(zhong)等范圍表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)unigenes的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)AUC（曲線(xian)下面積）占絕大(da)部分(fen)(fen)(fen)(fen)，低表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)或者高表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)unigenes的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)AUC是少部分(fen)(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)（圖(tu)2）。通過(guo)(guo)密(mi)度分(fen)(fen)(fen)(fen)布(bu)圖(tu)發(fa)現，纖(xian)維(wei)根(gen)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)unigenes要比(bi)莖(jing)和葉片(pian)(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)unigenes表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)高。盡管莖(jing)和葉片(pian)(pian)有相似的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)unigene表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)，莖(jing)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)稍(shao)微高于葉片(pian)(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)。另(ling)外(wai)分(fen)(fen)(fen)(fen)析編(bian)碼(ma)FPS,SS,SE和β-AS（β-香樹精(jing)合成酶）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)unigenes的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)，發(fa)現這些unigenes在葉片(pian)(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)高表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)，在纖(xian)維(wei)根(gen)中(zhong)(zhong)(zhong)低表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)，在莖(jing)中(zhong)(zhong)(zhong)要比(bi)纖(xian)維(wei)根(gen)中(zhong)(zhong)(zhong)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)高。編(bian)碼(ma)β-AS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)unigene在葉片(pian)(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)是纖(xian)維(wei)根(gen)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)將近125倍。通過(guo)(guo)DESeq軟件(jian)做兩(liang)兩(liang)比(bi)較分(fen)(fen)(fen)(fen)析測序數據(ju)，通過(guo)(guo)韋(wei)恩圖(tu)展現出差(cha)異(yi)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)unigene的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)布(bu)情況（圖(tu)3）。
表2 樣品(pin)中(zhong)unigenes的RPKM值(zhi)
表3unigenes兩兩比較上下調基因統計結果(guo)
圖(tu)2 unigenes的RPKM密(mi)度分布圖(tu)
圖(tu)3差異unigenes的韋恩(en)圖(tu)
分光光度法測定絞股藍的(de)皂(zao)苷(gan)(gan)含(han)量分布。所有(you)的(de)樣(yang)品中(zhong)葉片的(de)皂(zao)苷(gan)(gan)含(han)量高(gao)（3.189%），在莖（0.365%）或者纖(xian)維根（0.172%）中(zhong)皂(zao)苷(gan)(gan)含(han)量比較低。
表4 絞(jiao)股藍中皂苷含量(liang)分布
基于(yu)KEGG通路(lu)分(fen)析(xi)，將涉及三(san)(san)鐵合(he)成(cheng)(cheng)通路(lu)有關(guan)(guan)的(de)(de)(de)酶分(fen)為三(san)(san)類：1、IPP或者DMAPP合(he)成(cheng)(cheng)相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)酶；2、鯊(sha)烯合(he)成(cheng)(cheng)和(he)環化相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)酶；3、鯊(sha)烯功能(neng)化反應中(zhong)的(de)(de)(de)酶。文中(zhong)主要(yao)關(guan)(guan)注的(de)(de)(de)是FPS,SS和(he)SE三(san)(san)種酶，它們在三(san)(san)帖合(he)成(cheng)(cheng)和(he)環化中(zhong)起重要(yao)作用。首(shou)先FPS比(bi)較分(fen)析(xi)結(jie)果中(zhong)，只有纖(xian)維根和(he)葉片(pian)中(zhong)的(de)(de)(de)表達(da)比(bi)較有差(cha)異。再(zai)次，SS比(bi)較分(fen)析(xi)結(jie)果中(zhong)，兩(liang)組分(fen)析(xi)結(jie)果中(zhong)有差(cha)異，表明葉片(pian)中(zhong)的(de)(de)(de)表達(da)要(yao)高(gao)(gao)于(yu)纖(xian)維根和(he)莖。最(zui)后，在SE比(bi)較分(fen)析(xi)結(jie)果中(zhong)，葉片(pian)中(zhong)的(de)(de)(de)表達(da)高(gao)(gao)于(yu)莖和(he)纖(xian)維根，而 且纖(xian)維根中(zhong)的(de)(de)(de)表達(da)高(gao)(gao)于(yu)莖（圖(tu)4）。
; 圖4 FPS，SS，SE中基因的RPKM
在unigene功能注釋，RPKM表(biao)(biao)達(da)量統計和絞股(gu)藍(lan)含量測定之(zhi)后，分(fen)(fen)析unigene表(biao)(biao)達(da)，酶(mei)（unigene的(de)(de)產(chan)出物）的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)和絞股(gu)藍(lan)皂苷(gan)的(de)(de)含量分(fen)(fen)布之(zhi)間的(de)(de)關聯，發(fa)現(xian)unigene和酶(mei)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)與(yu)皂苷(gan)含量分(fen)(fen)布呈正相關。也就是說(shuo)樣本（纖(xian)維根，莖，葉片）中unigene和酶(mei)（FPS，SS和SE）的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)取決于皂苷(gan)含量的(de)(de)分(fen)(fen)布。這一結論，有利于絞股(gu)藍(lan)中其他(ta)次級(ji)代(dai)謝產(chan)物的(de)(de)深入研究。
文獻來源(yuan)
Chen Q, Ma C, Qian J, et al. Transcriptome Sequencing of Gynostemma pentaphyllum to Identify Genes and Enzymes Involved in Triterpenoid Biosynthesis[J]. International journal of genomics, 2016.
