2018-06-06
發表期刊：The Royal Society of Chemistry, RSC Advances
影響因子：3.108
派(pai)森諾生物與(yu)中國農業科學院油料作物研(yan)(yan)究所攜手合(he)作，于2018年(nian)3月20日在RSC Advances上發(fa)表(biao)了(le)關于GA對HCT116人結腸癌細胞表(biao)達影響的轉錄組分析(xi)的研(yan)(yan)究成(cheng)果《Transcriptome analysis reveals GA induced apoptosis in HCT116 human colon cancer cells through calcium and p53 signal pathways》。
研究背景：
羥(qian)基(ji)肉桂酸和(he)羥(qian)基(ji)苯(ben)(ben)甲酸是(shi)許多(duo)食用植物中常見的(de)(de)(de)食用酚酸和(he)微量(liang)營養素，在人體內具有顯(xian)著的(de)(de)(de)生(sheng)物活性(xing)。沒食子(zi)酸（GA）是(shi)一種(zhong)典型的(de)(de)(de)羥(qian)基(ji)苯(ben)(ben)甲酸，在許多(duo)水果和(he)蔬菜中廣泛分布(bu)，具有顯(xian)著的(de)(de)(de)抗氧化，抗炎，抗菌，抗病毒等生(sheng)物活性(xing)。先前的(de)(de)(de)報道(dao)顯(xian)示GA可以誘導(dao)結腸癌中的(de)(de)(de)細胞死亡，但關于其凋亡效應的(de)(de)(de)誘導(dao)機(ji)制尚未完全闡明。
研究方法：
樣(yang)本：三組(zu)人(ren)結腸(chang)癌(ai)HCT116細胞(bao)樣(yang)本（對(dui)照(zhao)組(zu) + GA處理(li) 12 h + GA處理(li)24 h）每組(zu)三個(ge)重復(fu)
平臺：Illumina HiSeq
研究結果：
1. GA對細胞增殖(zhi)的影響(xiang)
通過CCK8試(shi)驗，評估了GA對(dui)結腸癌細(xi)(xi)(xi)胞(bao)增殖和生(sheng)長的(de)影響。如圖1a所示，24 h的(de)GA處理(li)以(yi)劑量(liang)依賴(lai)性的(de)方式顯著降(jiang)低(di)了HCT116和SW48細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)存(cun)活(huo)能力(li)(li)，且(qie)HCT116細(xi)(xi)(xi)胞(bao)對(dui)GA的(de)敏感性高于(yu)SW48和RKO細(xi)(xi)(xi)胞(bao)。另外(wai)還發現(xian)，GA對(dui)HCT116細(xi)(xi)(xi)胞(bao)有一種依賴(lai)時(shi)間的(de)抑制作用(yong)(yong)（圖1b）。在(zai)使(shi)用(yong)(yong)50 mM GA處理(li)后，HCT116細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)存(cun)活(huo)能力(li)(li)急(ji)劇(ju)下降(jiang)（12 h到60.5%，，24小(xiao)時(shi)內達(da)到34.8%）。然而(er)，在(zai)較低(di)的(de)GA濃度(du)下，12 h和24 h細(xi)(xi)(xi)胞(bao)存(cun)活(huo)能力(li)(li)幾乎(hu)沒有任何區(qu)別。
2. GA對HCT116細(xi)胞(bao)凋亡的(de)影響(xiang)
使(shi)用(yong)膜聯蛋白V-PI雙重(zhong)染色(se)和流動(dong)儀結(jie)果(guo)來(lai)評估細(xi)胞凋(diao)亡（Fig. 2）。與對照(zhao)組相(xiang)比，25 mM 、50 mM 、100 mM GA處理24h后的(de)凋(diao)亡細(xi)胞的(de)百分比(右(you)上(shang))顯著增加。結(jie)果(guo)表明，通過誘(you)導細(xi)胞凋(diao)亡，GA可以部分抑制(zhi)HCT116細(xi)胞的(de)增殖。
3. GA對基(ji)因表(biao)達模式(shi)的影響(xiang)
在不(bu)同的(de)(de)時(shi)間(jian)點上對總(zong)體(ti)轉錄組的(de)(de)差異進行分析(xi)，熱圖(tu)(tu)見圖(tu)(tu)3a。在每(mei)個序(xu)列樣(yang)本(ben)中，有超過67%的(de)(de)基(ji)因(yin)表(biao)達（RPKM > 1）。主成(cheng)分分析(xi)（圖(tu)(tu)3b）表(biao)明，在一(yi)個組中，相(xiang)似的(de)(de)樣(yang)本(ben)聚集(ji)在一(yi)起，這與熱圖(tu)(tu)結(jie)果一(yi)致(zhi)。GA處(chu)(chu)理12 h與未處(chu)(chu)理和(he)24 h處(chu)(chu)理的(de)(de)細胞形成(cheng)了一(yi)個截然不(bu)同的(de)(de)集(ji)群。
12 h GA處(chu)理(li)后61個(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)（7.7%）的(de)表達(da)增加，730（92.3%）個(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)表達(da)減少（圖(tu)4a）。相比(bi)之(zhi)下，在(zai)處(chu)理(li)12 h 到(dao)24 h過程中(zhong)，有超過93.2%的(de)差異表達(da)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)（849個(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)）上調(diao)，只有6.8%（62個(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)）的(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)下調(diao)。每個(ge)(ge)(ge)成對比(bi)較組(zu)(zu)之(zhi)間的(de)共有特有DEGs在(zai)維恩圖(tu)中(zhong)顯示(Fig. 4b)。轉錄組(zu)(zu)分(fen)析顯示，在(zai)前12h和后12h的(de)處(chu)理(li)過程中(zhong)，共享648個(ge)(ge)(ge)差異基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)，他們的(de)調(diao)節模式存在(zai)差異。GA12-C組(zu)(zu)中(zhong)611個(ge)(ge)(ge)下調(diao)的(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)在(zai)GA24- GA12組(zu)(zu)中(zhong)是上調(diao)的(de)。GA12-C組(zu)(zu)中(zhong)37個(ge)(ge)(ge)上調(diao)的(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)在(zai)GA24- GA12組(zu)(zu)中(zhong)下調(diao)。在(zai)GA24-C組(zu)(zu)和GA24-GA12組(zu)(zu)中(zhong)檢(jian)測到(dao)14個(ge)(ge)(ge)DEGs。
4. DEGs 的GO和 KEGG富集分析
圖5a中展示了(le)前30個(ge)富(fu)集的(de)GO terms。C-GA12組的(de)791個(ge)DEGs中738個(ge)基因顯著富(fu)集在(zai)(zai)鈣離(li)子結合、血漿膜、胞(bao)(bao)外(wai)區和(he)單多細(xi)胞(bao)(bao)生物過(guo)程的(de)GO terms上。隨著處理時(shi)間延長，DEGs的(de)數(shu)量(liang)增加。在(zai)(zai)GA12和(he)GA24之(zhi)間，大約92.8%（845個(ge)）的(de)DEGs被歸類到(dao)4577個(ge) GO terms，顯著富(fu)集在(zai)(zai)鈣離(li)子結合及相(xiang)關渠道、血漿膜、胞(bao)(bao)外(wai)區域(yu)和(he)細(xi)胞(bao)(bao)外(wai)圍等(deng)功能上。當(dang)C組與GA24組的(de)細(xi)胞(bao)(bao)進(jin)行比較時(shi)，只(zhi)富(fu)集到(dao)FMN結合功能上。
圖5b顯(xian)示(shi)了在前(qian)12 h和(he)(he)后(hou)12 h處理中(zhong)，DEGs的(de)前(qian)20個顯(xian)著(zhu)富集的(de)KEGG通(tong)(tong)路。大部分(fen)都涉及(ji)到(dao)(dao)新陳代(dai)謝(xie)和(he)(he)信(xin)號(hao)轉導(dao)。富集的(de)路徑主(zhu)要(yao)與(yu)組織系統和(he)(he)環(huan)境信(xin)息(xi)處理有(you)關。此外，還有(you)與(yu)脂(zhi)質(zhi)代(dai)謝(xie)和(he)(he)環(huan)境適(shi)應有(you)關的(de)精氨酸和(he)(he)脯氨酸代(dai)謝(xie)以及(ji)晝夜(ye)節律的(de)通(tong)(tong)路。長時(shi)(shi)間(jian)的(de)GA處理組得到(dao)(dao)的(de)差異基因主(zhu)要(yao)富集在鈣(gai)信(xin)號(hao)通(tong)(tong)路、花生酸代(dai)謝(xie)、細(xi)胞(bao)粘(zhan)附(fu)分(fen)子和(he)(he)ErbB信(xin)號(hao)通(tong)(tong)路，同時(shi)(shi)還觀(guan)察到(dao)(dao)與(yu)細(xi)胞(bao)群落和(he)(he)細(xi)胞(bao)生長和(he)(he)死亡相(xiang)關的(de)兩種通(tong)(tong)路，焦點粘(zhan)連和(he)(he)p53信(xin)號(hao)通(tong)(tong)路。
5. 與增殖和細胞凋亡相關的代謝途徑
來(lai)自前10個顯著富集途徑的(de)(de)基因(yin)可以被認為是(shi)GA處理(li)的(de)(de)重(zhong)要調控(kong)因(yin)子（特別(bie)是(shi)C-GA12組(zu)(zu)和GA12-GA24組(zu)(zu)之間(jian)共(gong)有的(de)(de)差異基因(yin)），具體結果見Table 1。大部分基因(yin)表達模式顯示(shi)，在(zai)24 h的(de)(de)處理(li)期間(jian)是(shi)開始下(xia)調，然后上調。但是(shi)基因(yin)Per2 ，NRG1以及THBS1在(zai)C-GA12組(zu)(zu)中(zhong)上調，在(zai)GA12-GA24組(zu)(zu)中(zhong)下(xia)調。
基于(yu)GO和(he)KEGG富集(ji)分析，對由GA處理(li)引(yin)起(qi)的HCT116細(xi)(xi)(xi)胞的變化進行概述。如(ru)圖6所示，GA通過下調(diao)鈣通道阻(zu)斷早期治療中的細(xi)(xi)(xi)胞生長(chang)，然后(hou)通過激活(huo)凋(diao)亡半胱天冬(dong)酶上調(diao)內源(yuan)性p53信號(hao)途徑來觸發HCT116細(xi)(xi)(xi)胞的細(xi)(xi)(xi)胞凋(diao)亡，最(zui)終引(yin)發線粒(li)體(ti)凋(diao)亡途徑。這(zhe)表明，為了對GA處理(li)作出反應(ying)，HCT116細(xi)(xi)(xi)胞可(ke)能會重新規劃基因表達(da)，以優(you)化信號(hao)轉(zhuan)導，從而實現更有效的適應(ying)。
6. RT-qPCR驗證RNA-seq結果
我們隨(sui)機選(xuan)擇了12個(ge)不同代謝(xie)途徑的(de)DEGs來驗證它們的(de)表(biao)達水平，結(jie)果(guo)(guo)(guo)見Table 2。RT-qPCR結(jie)果(guo)(guo)(guo)顯示(shi)驗證結(jie)果(guo)(guo)(guo)與RNA-seq結(jie)果(guo)(guo)(guo)一致，表(biao)明RNA-seq的(de)結(jie)果(guo)(guo)(guo)相當可(ke)信。
原文索引：
Yang C, Xie X, Tang H, et al. Transcriptome analysis reveals GA induced apoptosis in HCT116 human colon cancer cells through calcium and p53 signal pathways[J]. Rsc Advances, 2018, 8(22):12449-12458.
