DNA測(ce)序(xu)(xu)的(de)原理是末端終止(zhi)法。具體(ti)步驟如下： 1． 定量：對樣品(pin)及引(yin)物(wu)進行定量。 2． 測(ce)序(xu)(xu)反(fan)(fan)應(ying)：在(zai)反(fan)(fan)應(ying)體(ti)系中(zhong)加入(ru)已定量的(de)模板和(he)引(yin)物(wu)，BigDye等(deng)試劑(ji)，PCR儀(yi)上完成測(ce)序(xu)(xu)反(fan)(fan)應(ying)。 3． 讀取數據：根據熒光的(de)不同，讀取被測(ce)樣品(pin)的(de)堿(jian)基序(xu)(xu)列。 ABI公司目前測(ce)序(xu)(xu)結果在(zai)800bp以內準(zhun)確率為(wei)98.5%。                                    

 如(ru)果(guo)(guo)您(nin)(nin)(nin)提(ti)供(gong)的(de)(de)(de)(de)(de)樣品是(shi)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)，在測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)報(bao)告上找(zhao)不(bu)(bu)(bu)(bu)到(dao)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)是(shi)正常的(de)(de)(de)(de)(de)。這是(shi)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)為(wei)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)反應是(shi)通過對(dui)被熒(ying)(ying)光標(biao)記的(de)(de)(de)(de)(de)ddNTP的(de)(de)(de)(de)(de)讀取而獲得基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)，而測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)由(you)于(yu)(yu)(yu)沒有(you)(you)(you)熒(ying)(ying)光標(biao)記，因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)自(zi)然在測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)結果(guo)(guo)中就不(bu)(bu)(bu)(bu)會被識別。有(you)(you)(you)兩(liang)種方法(fa)(fa)可(ke)以(yi)得到(dao)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列。對(dui)于(yu)(yu)(yu)較(jiao)短的(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)（<800bp），可(ke)以(yi)用另一端(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)進行(xing)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)，從(cong)另一端(duan)(duan)(duan)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)可(ke)以(yi)一直測(ce)(ce)(ce)(ce)到(dao)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)末端(duan)(duan)(duan)，就可(ke)以(yi)在序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)末端(duan)(duan)(duan)得到(dao)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)反向(xiang)互補序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列。對(dui)于(yu)(yu)(yu)較(jiao)長(chang)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列，一個(ge)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)反應測(ce)(ce)(ce)(ce)不(bu)(bu)(bu)(bu)到(dao)頭，因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)就只能將(jiang)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)片段(duan)克(ke)隆到(dao)適(shi)當(dang)(dang)的(de)(de)(de)(de)(de)載體(ti)(ti)中，用載體(ti)(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)通用引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)進行(xing)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)。由(you)于(yu)(yu)(yu)載體(ti)(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)通用引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)與(yu)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)插入序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列之間還(huan)有(you)(you)(you)一段(duan)距(ju)離(li)，因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)就可(ke)以(yi)得到(dao)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)完整的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列。由(you)于(yu)(yu)(yu)在測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)起始端(duan)(duan)(duan)總會有(you)(you)(you)一些(xie)堿基(ji)無(wu)(wu)法(fa)(fa)準確讀出，因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)，您(nin)(nin)(nin)如(ru)果(guo)(guo)想得到(dao)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)完整序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列，克(ke)隆后(hou)進行(xing)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)。 如(ru)果(guo)(guo)您(nin)(nin)(nin)提(ti)供(gong)的(de)(de)(de)(de)(de)樣品是(shi)質(zhi)粒或菌液，PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)用T載體(ti)(ti)克(ke)隆后(hou)，由(you)于(yu)(yu)(yu)克(ke)隆的(de)(de)(de)(de)(de)方向(xiang)是(shi)隨機的(de)(de)(de)(de)(de)，因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)，當(dang)(dang)您(nin)(nin)(nin)在一條鏈上找(zhao)不(bu)(bu)(bu)(bu)到(dao)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列時(shi)，試圖(tu)在互補鏈上尋找(zhao)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列。 當(dang)(dang)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)離(li)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)插入片段(duan)很近(jin)時(shi)，有(you)(you)(you)時(shi)可(ke)能也無(wu)(wu)法(fa)(fa)找(zhao)到(dao)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)全序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列。這主要是(shi)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)為(wei)有(you)(you)(you)時(shi)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)起始端(duan)(duan)(duan)由(you)于(yu)(yu)(yu)未去除的(de)(de)(de)(de)(de)染料或引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)二聚體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)干擾(rao)，造成起始區的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列不(bu)(bu)(bu)(bu)好，可(ke)能無(wu)(wu)法(fa)(fa)找(zhao)到(dao)您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)完整序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列。 有(you)(you)(you)時(shi)，質(zhi)粒做(zuo)模板進行(xing)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)時(shi)，由(you)于(yu)(yu)(yu)某些(xie)原因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，質(zhi)粒上沒有(you)(you)(you)插入外源片段(duan)，為(wei)空載體(ti)(ti)，所測(ce)(ce)(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列為(wei)載體(ti)(ti)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列，此(ci)(ci)時(shi)自(zi)然也找(zhao)不(bu)(bu)(bu)(bu)到(dao)引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列。                                    

首先過(guo)短(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)純(chun)化困難，一(yi)般的(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)純(chun)化試劑盒都要求(qiu)PCR產(chan)物(wu)(wu)片(pian)段大于(yu)200bp，過(guo)短(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)純(chun)化和準確定量都非常困難。因此我(wo)們要求(qiu)用(yong)于(yu)測(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)一(yi)般不低于(yu)200bp長(chang)度。 其次，由(you)于(yu)測(ce)序(xu)(xu)本身的(de)(de)(de)(de)(de)限制，以一(yi)個100bp的(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)用(yong)于(yu)測(ce)序(xu)(xu)為(wei)例(li)，去掉兩(liang)個引物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列大約40到50bp，再(zai)加(jia)上測(ce)序(xu)(xu)起始端的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)些讀不出的(de)(de)(de)(de)(de)堿基(ji)，真正能(neng)夠(gou)得到的(de)(de)(de)(de)(de)有用(yong)序(xu)(xu)列不過(guo)30～40堿基(ji)。上面是(shi)在理(li)想的(de)(de)(de)(de)(de)條(tiao)件下的(de)(de)(de)(de)(de)假設，稍不順利，測(ce)序(xu)(xu)就失敗了。因此，過(guo)短(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)，只能(neng)克(ke)隆后進行測(ce)序(xu)(xu)。                                 &nbsp;  

用(yong)于測(ce)(ce)序的引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)比用(yong)作PCR反應的引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)要求(qiu)高，以下是不(bu)適合用(yong)于測(ce)(ce)序反應的引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)類(lei)型： 1. 不(bu)純的引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)：用(yong)于測(ce)(ce)序的引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)純度要求(qiu)很高，合成中的小(xiao)片段會(hui)直(zhi)接造成嚴重的背景峰，因(yin)此用(yong)于測(ce)(ce)序的引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)序列長度一般在(zai)24個堿基之內。 2. 簡并引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)，隨機引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)和(he)有特殊標(biao)記的引(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)。     &nbsp;                              

非常抱歉，目前我公司不(bu)會(hui)單獨(du)對客戶的測(ce)序反應設定(ding)特定(ding)的條件(jian)，測(ce)序反應均在(zai)統一的條件(jian)下完成。                                 &nbsp;  

PCR產(chan)(chan)物(wu)(wu)電泳(yong)檢測(ce)的(de)(de)結果只(zhi)是(shi)一(yi)個粗略的(de)(de)定(ding)性結果。對(dui)(dui)于(yu)(yu)與目的(de)(de)片段條帶大小只(zhi)相(xiang)差幾(ji)個堿基(ji)的(de)(de)非特異性PCR擴增產(chan)(chan)物(wu)(wu)是(shi)無法用肉眼(yan)區分開(kai)的(de)(de)。但是(shi)DNA測(ce)序(xu)反(fan)應(ying)(ying)敏(min)感而客觀，可(ke)以直接反(fan)應(ying)(ying)出模板本身的(de)(de)情(qing)況。需要強調的(de)(de)是(shi)，高質(zhi)(zhi)量的(de)(de)PCR產(chan)(chan)物(wu)(wu)才可(ke)能得到高質(zhi)(zhi)量的(de)(de)測(ce)序(xu)結果，如果您(nin)(nin)對(dui)(dui)PCR產(chan)(chan)物(wu)(wu)的(de)(de)純度不很(hen)確定(ding)，希望您(nin)(nin)可(ke)以將PCR產(chan)(chan)物(wu)(wu)進(jin)行克(ke)隆處理(li)，得到好的(de)(de)測(ce)序(xu)結果。以下圖為例：該反(fan)應(ying)(ying)的(de)(de)背景信號較高，不利(li)于(yu)(yu)堿基(ji)的(de)(de)判讀(du)。

解決辦法：改變PCR條件，重新擴增。或(huo)者可以(yi)將(jiang)該PCR產(chan)物(wu)克隆(long)到(dao)質粒中，初(chu)步篩選后(hou)進(jin)行單克隆(long)測序。

以下圖為例(li)：

堿基(ji)缺失常見在PCR產物中，特別(bie)是從基(ji)因組中擴增得到的(de)PCR片段，上圖的(de)186位缺失兩個(ge)連續(xu)的(de)T。

解(jie)決方法：1) 使用反向引(yin)物(wu)繼續測序，以矯正缺失(shi)位點并(bing)達(da)到測通的目的。或者將該(gai)PCR產物(wu)克隆到質粒(li)中，挑取單(dan)克隆測序。

2) 如果可以確定該(gai)PCR片(pian)段中(zhong)不應該(gai)有缺(que)失的位(wei)點，那么可以改變PCR反應條件，重新(xin)擴增。

以下圖為例(li)：

引物(wu)不(bu)純造成移碼現(xian)象(xiang)，該種現(xian)象(xiang)與模板雜在(zai)峰圖都(dou)表現(xian)為背景峰較雜，但(dan)是引物(wu)不(bu)純在(zai)峰圖上表現(xian)的更有規(gui)律，一(yi)(yi)般在(zai)每一(yi)(yi)個主峰前都(dou)有一(yi)(yi)個同一(yi)(yi)堿基的小峰。

解決方法：重新(xin)合(he)成引物(wu)，或者將(jiang)引物(wu)進(jin)行PAGE純化后(hou)再(zai)進(jin)行測序。

以下圖為(wei)例：

重復(fu)結構將導致測序(xu)復(fu)制框的滑移(yi)，重復(fu)結構之后(hou)峰型混亂。

解決(jue)辦法：使用反向(xiang)引(yin)物(wu)對模(mo)板(ban)進行測序，測到該重復結構處，即可(ke)完成模(mo)板(ban)全長的(de)拼接。

以(yi)下(xia)圖為例：

上圖是pGEM-T載(zai)體測序的(de)結(jie)果，在(zai)(zai)83位點處測序結(jie)果出(chu)現雙(shuang)(shuang)峰，即測序結(jie)果在(zai)(zai)載(zai)體部分很(hen)(hen)準確(que)，而(er)進入(ru)插入(ru)片段后出(chu)現雙(shuang)(shuang)峰的(de)情況。這(zhe)是由于在(zai)(zai)接(jie)種時(shi)沒(mei)有(you)挑(tiao)單菌落導致的(de)，當兩個以上的(de)正(zheng)常(chang)(chang)的(de)克隆(long)(long)（插入(ru)片段方向相反(fan)），或(huo)正(zheng)常(chang)(chang)克隆(long)(long)與空載(zai)體混在(zai)(zai)一起，而(er)通過(guo)酶切和PCR鑒定很(hen)(hen)難(nan)看出(chu)異常(chang)(chang)，尤其在(zai)(zai)T-A克隆(long)(long)時(shi)經常(chang)(chang)碰到。

解決辦法：重新涂平板(ban)挑單菌落測(ce)序。需要(yao)注(zhu)意的(de)是，重新進行PCR反應或者酶切鑒定(ding)僅能證明該(gai)克隆(long)含有插入片段，并不(bu)足以證明模板(ban)的(de)單一。

對于(yu)PCR產物也(ye)同樣有(you)模(mo)板(ban)不單一(yi)的(de)情況(kuang)，如(ru)下圖(tu)所示，

在197bp前測(ce)序峰表現為(wei)雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一(yi)個(ge)高高的A峰，峰標志(zhi)著(zhu)此PCR產物中有一(yi)個(ge)片段大(da)小(xiao)為(wei)200bp左右的小(xiao)片段。

解決方法：對PCR產(chan)物(wu)切膠純化，再進行測序。

以(yi)下(xia)圖(tu)為例：

以polyT為例，在polyA/T結構(gou)之后(hou)往(wang)往(wang)出現(xian)移碼(ma)現(xian)象，而(er)在polyG/C之后(hou)會往(wang)往(wang)導致(zhi)測(ce)序信(xin)號的衰減。

解決辦法：使用反(fan)向引物對模(mo)板進行(xing)測(ce)序，測(ce)到該poly結構處，即可完成模(mo)板全長(chang)的拼接。

以下圖為例：

位點94至(zhi)137是一(yi)個回文結(jie)構(gou)，該結(jie)構(gou)導致后面的(de)信(xin)號(hao)衰減，出現錯誤的(de)判(pan)讀。

解決(jue)方法：使用反(fan)向引物對模(mo)板進(jin)行測序，測到該(gai)回文結構處(chu)，即(ji)可完成模(mo)板全長(chang)的拼接。

鹽(yan)分(fen)(fen)高(gao)是(shi)(shi)(shi)指客(ke)戶(hu)提供的(de)(de)(de)PCR產物(wu)中的(de)(de)(de)鹽(yan)離(li)子濃(nong)度(du)高(gao)。造(zao)成樣(yang)品鹽(yan)離(li)子高(gao)的(de)(de)(de)原因是(shi)(shi)(shi)由于(yu)(yu)(yu)客(ke)戶(hu)在進行PCR反應時，在反應體(ti)系(xi)中加入(ru)的(de)(de)(de)鹽(yan)離(li)子濃(nong)度(du)過(guo)高(gao)。鹽(yan)離(li)子的(de)(de)(de)來源有PCR反應體(ti)系(xi)中的(de)(de)(de)緩沖液即buffer，有些情(qing)況(kuang)下是(shi)(shi)(shi)由單(dan)獨加入(ru)的(de)(de)(de)鎂離(li)子造(zao)成的(de)(de)(de)。對(dui)(dui)于(yu)(yu)(yu)這種樣(yang)品，通(tong)(tong)過(guo)電泳檢(jian)測(ce)是(shi)(shi)(shi)不能(neng)對(dui)(dui)其進行區分(fen)(fen)的(de)(de)(de)，只有在測(ce)序結(jie)果(guo)出(chu)來后(hou)分(fen)(fen)析峰圖(tu)才可(ke)能(neng)發現問題(ti)所在，典(dian)型(xing)(xing)的(de)(de)(de)峰圖(tu)表現為前70-80甚(shen)至100個堿基的(de)(de)(de)峰型(xing)(xing)基線(xian)漂離(li)，嚴重影(ying)響(xiang)測(ce)序結(jie)果(guo)前面(mian)部分(fen)(fen)的(de)(de)(de)準確性。由于(yu)(yu)(yu)通(tong)(tong)過(guo)純化的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)只能(neng)部分(fen)(fen)的(de)(de)(de)去(qu)除少量鹽(yan)分(fen)(fen)，無(wu)法(fa)解決(jue)鹽(yan)離(li)子對(dui)(dui)測(ce)序結(jie)果(guo)的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)。