DNA測(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)原理是末端終止(zhi)法。具體步(bu)驟如下： 1． 定(ding)量(liang)：對(dui)樣品(pin)及(ji)引(yin)物進行(xing)定(ding)量(liang)。 2． 測(ce)(ce)序(xu)(xu)反(fan)應：在(zai)反(fan)應體系(xi)中加入已定(ding)量(liang)的(de)模板(ban)和引(yin)物，BigDye等試(shi)劑(ji)，PCR儀上完成(cheng)測(ce)(ce)序(xu)(xu)反(fan)應。 3． 讀取(qu)數據：根據熒光的(de)不(bu)同，讀取(qu)被測(ce)(ce)樣品(pin)的(de)堿基序(xu)(xu)列(lie)。 ABI公(gong)司目前測(ce)(ce)序(xu)(xu)結果(guo)在(zai)800bp以內準確率為98.5%。                                    

 如果您(nin)(nin)(nin)提供的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)樣品是PCR產(chan)(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)，在測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)報告(gao)上找不(bu)(bu)到您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)是正常的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。這(zhe)是因(yin)(yin)(yin)為(wei)(wei)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)反(fan)應是通(tong)(tong)過對(dui)被(bei)熒光標(biao)記(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ddNTP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)讀取(qu)而獲得基因(yin)(yin)(yin)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，而測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)由(you)于(yu)沒(mei)有(you)熒光標(biao)記(ji)，因(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)自然在測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)結果中(zhong)就不(bu)(bu)會被(bei)識別(bie)。有(you)兩種方法可以(yi)得到您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)。對(dui)于(yu)較短的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)（<800bp），可以(yi)用(yong)另(ling)一(yi)端(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)進(jin)(jin)(jin)行(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)，從另(ling)一(yi)端(duan)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)可以(yi)一(yi)直測(ce)(ce)到序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)末端(duan)，就可以(yi)在序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)末端(duan)得到您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)反(fan)向(xiang)互補序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)。對(dui)于(yu)較長的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)，一(yi)個(ge)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)反(fan)應測(ce)(ce)不(bu)(bu)到頭(tou)，因(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)就只(zhi)能(neng)(neng)將您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)片段(duan)克隆(long)到適當的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)載(zai)體(ti)(ti)(ti)中(zhong)，用(yong)載(zai)體(ti)(ti)(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)通(tong)(tong)用(yong)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)進(jin)(jin)(jin)行(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)。由(you)于(yu)載(zai)體(ti)(ti)(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)通(tong)(tong)用(yong)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)與您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)插入(ru)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)之間還有(you)一(yi)段(duan)距離，因(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)就可以(yi)得到您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)完(wan)(wan)整的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)。由(you)于(yu)在測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)起始端(duan)總(zong)會有(you)一(yi)些堿基無法準確(que)讀出(chu)，因(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)，您(nin)(nin)(nin)如果想得到您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PCR產(chan)(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)完(wan)(wan)整序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)，克隆(long)后進(jin)(jin)(jin)行(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)。 如果您(nin)(nin)(nin)提供的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)樣品是質粒或菌液，PCR產(chan)(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)用(yong)T載(zai)體(ti)(ti)(ti)克隆(long)后，由(you)于(yu)克隆(long)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方向(xiang)是隨機的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，因(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)，當您(nin)(nin)(nin)在一(yi)條鏈(lian)上找不(bu)(bu)到您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)時(shi)(shi)，試圖在互補鏈(lian)上尋(xun)找您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)。 當測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)離您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)插入(ru)片段(duan)很(hen)近時(shi)(shi)，有(you)時(shi)(shi)可能(neng)(neng)也(ye)無法找到您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)全序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)。這(zhe)主要是因(yin)(yin)(yin)為(wei)(wei)有(you)時(shi)(shi)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)起始端(duan)由(you)于(yu)未去除的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)染料或引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)二聚體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)干擾(rao)，造(zao)成起始區的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)不(bu)(bu)好，可能(neng)(neng)無法找到您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)完(wan)(wan)整序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)。 有(you)時(shi)(shi)，質粒做模板(ban)進(jin)(jin)(jin)行(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)時(shi)(shi)，由(you)于(yu)某些原因(yin)(yin)(yin)，質粒上沒(mei)有(you)插入(ru)外源片段(duan)，為(wei)(wei)空載(zai)體(ti)(ti)(ti)，所測(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)為(wei)(wei)載(zai)體(ti)(ti)(ti)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)，此(ci)(ci)時(shi)(shi)自然也(ye)找不(bu)(bu)到引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)。                                    

首先過短的(de)(de)PCR產物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)純(chun)化困(kun)難，一般(ban)的(de)(de)PCR產物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)純(chun)化試劑盒都(dou)要求PCR產物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)片段大于200bp，過短的(de)(de)PCR產物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)純(chun)化和準確定量都(dou)非常困(kun)難。因此(ci)我們(men)要求用于測序(xu)的(de)(de)PCR產物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)一般(ban)不(bu)低于200bp長(chang)度。 其次，由于測序(xu)本身(shen)的(de)(de)限制，以一個100bp的(de)(de)PCR產物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)用于測序(xu)為(wei)例(li)，去(qu)掉兩(liang)個引物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)序(xu)列(lie)(lie)大約40到50bp，再加上測序(xu)起始端的(de)(de)一些(xie)讀不(bu)出的(de)(de)堿基，真正能夠得(de)到的(de)(de)有用序(xu)列(lie)(lie)不(bu)過30～40堿基。上面是(shi)在理想的(de)(de)條件下的(de)(de)假設(she)，稍不(bu)順利，測序(xu)就失敗了。因此(ci)，過短的(de)(de)PCR產物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)，只(zhi)能克隆后進行測序(xu)。                                    

用(yong)(yong)(yong)于測(ce)(ce)序(xu)的(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)比用(yong)(yong)(yong)作PCR反應(ying)的(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)要求(qiu)高，以下是不(bu)適(shi)合用(yong)(yong)(yong)于測(ce)(ce)序(xu)反應(ying)的(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)類型： 1. 不(bu)純(chun)的(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)：用(yong)(yong)(yong)于測(ce)(ce)序(xu)的(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)純(chun)度要求(qiu)很高，合成中(zhong)的(de)(de)(de)小片段會直接造成嚴重的(de)(de)(de)背(bei)景峰，因此用(yong)(yong)(yong)于測(ce)(ce)序(xu)的(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)序(xu)列長度一般在24個(ge)堿基之內(nei)。 2. 簡并引(yin)物(wu)(wu)(wu)，隨機引(yin)物(wu)(wu)(wu)和有特(te)殊(shu)標記的(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)。                                    

非常抱(bao)歉，目前我公司不會單獨對(dui)客戶的(de)測(ce)序(xu)反應(ying)設定特(te)定的(de)條件，測(ce)序(xu)反應(ying)均在統一(yi)的(de)條件下完成。 &nbsp;                                  

PCR產(chan)物(wu)電(dian)泳檢測(ce)的(de)(de)結果只(zhi)是(shi)一個粗(cu)略的(de)(de)定性結果。對于與目的(de)(de)片段條帶大小只(zhi)相差幾個堿(jian)基(ji)的(de)(de)非特(te)異性PCR擴增(zeng)產(chan)物(wu)是(shi)無法用肉眼區分開的(de)(de)。但是(shi)DNA測(ce)序反應敏(min)感(gan)而客觀，可(ke)以(yi)直接反應出(chu)模板本身(shen)的(de)(de)情況。需要強調的(de)(de)是(shi)，高(gao)質量的(de)(de)PCR產(chan)物(wu)才可(ke)能得(de)到高(gao)質量的(de)(de)測(ce)序結果，如果您對PCR產(chan)物(wu)的(de)(de)純(chun)度不很確定，希望您可(ke)以(yi)將PCR產(chan)物(wu)進行克隆處理，得(de)到好的(de)(de)測(ce)序結果。以(yi)下圖為(wei)例：該(gai)反應的(de)(de)背景信號較高(gao)，不利于堿(jian)基(ji)的(de)(de)判(pan)讀。

解決辦法：改變PCR條件，重新擴增。或者可以將該PCR產物克隆(long)到質粒中(zhong)，初步篩選后(hou)進行單克隆(long)測序。

以下圖(tu)為(wei)例：

堿基(ji)缺失(shi)常見在PCR產物中，特別是從基(ji)因(yin)組中擴增得到的(de)PCR片段，上圖的(de)186位(wei)缺失(shi)兩個(ge)連續的(de)T。

解(jie)決方法：1) 使(shi)用反向引物繼續(xu)測序，以(yi)矯正缺失位(wei)點并(bing)達到測通的目的。或者將該PCR產(chan)物克隆到質粒(li)中，挑取(qu)單克隆測序。

2) 如果可以確定該(gai)PCR片段中(zhong)不應該(gai)有(you)缺失的(de)位點(dian)，那(nei)么可以改變PCR反應條件，重(zhong)新擴(kuo)增。

以下圖為例：

引物不(bu)純(chun)造成移碼現(xian)象，該種(zhong)現(xian)象與模板雜(za)在峰(feng)(feng)圖都表現(xian)為(wei)背景峰(feng)(feng)較雜(za)，但是引物不(bu)純(chun)在峰(feng)(feng)圖上表現(xian)的(de)(de)更(geng)有規律，一般在每一個主(zhu)峰(feng)(feng)前都有一個同(tong)一堿基的(de)(de)小(xiao)峰(feng)(feng)。

解(jie)決方法：重(zhong)新合(he)成引物，或者將(jiang)引物進行(xing)PAGE純化后再進行(xing)測序。

以下圖為例(li)：

重復結(jie)(jie)構將導(dao)致測(ce)序復制框的滑移，重復結(jie)(jie)構之后峰型混亂。

解決(jue)辦法：使用反向引(yin)物對(dui)模(mo)板(ban)進行測(ce)序，測(ce)到該重復(fu)結(jie)構處，即可完成模(mo)板(ban)全長的拼接。

以下圖為(wei)例：

上(shang)圖是pGEM-T載體(ti)測序(xu)(xu)的(de)結果，在(zai)(zai)(zai)83位點處測序(xu)(xu)結果出現(xian)雙峰，即測序(xu)(xu)結果在(zai)(zai)(zai)載體(ti)部分(fen)很(hen)準確，而進入插入片(pian)段(duan)后(hou)出現(xian)雙峰的(de)情(qing)況。這是由(you)于在(zai)(zai)(zai)接種時沒有(you)挑單菌落導致的(de)，當(dang)兩個以上(shang)的(de)正常(chang)(chang)的(de)克(ke)隆（插入片(pian)段(duan)方(fang)向(xiang)相反(fan)），或(huo)正常(chang)(chang)克(ke)隆與空載體(ti)混(hun)在(zai)(zai)(zai)一起，而通過酶切和PCR鑒定很(hen)難看出異常(chang)(chang)，尤其在(zai)(zai)(zai)T-A克(ke)隆時經常(chang)(chang)碰到。

解決辦法：重新(xin)涂平板挑單(dan)菌落測(ce)序。需要(yao)注意的是(shi)，重新(xin)進行PCR反應或者(zhe)酶(mei)切鑒定僅能(neng)證明該克隆含(han)有(you)插入(ru)片段，并不足以證明模板的單(dan)一。

對于PCR產物也同樣有模板不單一的情(qing)況，如下(xia)圖所示，

在(zai)197bp前測序峰(feng)(feng)表現(xian)為(wei)雜或(huo)有(you)明顯套峰(feng)(feng)，且在(zai)197bp位置有(you)一個(ge)高(gao)高(gao)的(de)A峰(feng)(feng)，峰(feng)(feng)標(biao)志著此PCR產物中有(you)一個(ge)片段(duan)大小為(wei)200bp左右的(de)小片段(duan)。

解決方法：對PCR產物切膠(jiao)純化，再(zai)進行測(ce)序(xu)。

以(yi)下圖為例：

以polyT為例，在polyA/T結構(gou)之后往(wang)往(wang)出現(xian)移碼現(xian)象(xiang)，而在polyG/C之后會往(wang)往(wang)導致(zhi)測序(xu)信(xin)號的(de)衰減(jian)。

解決(jue)辦法：使(shi)用反向(xiang)引物(wu)對模(mo)板進行測序，測到該poly結構處，即(ji)可完成模(mo)板全長的拼接(jie)。

以下(xia)圖為例：

位點94至137是一個回文結構，該結構導致(zhi)后(hou)面的信(xin)號衰減，出現錯(cuo)誤的判(pan)讀。

解(jie)決方法(fa)：使用反向(xiang)引物對模板進(jin)行測序，測到(dao)該回文結構處，即(ji)可完成模板全長(chang)的拼接。

鹽(yan)(yan)分(fen)高是指客戶提供的(de)(de)(de)(de)PCR產物中的(de)(de)(de)(de)鹽(yan)(yan)離(li)(li)子(zi)濃(nong)(nong)度(du)高。造成樣品鹽(yan)(yan)離(li)(li)子(zi)高的(de)(de)(de)(de)原因是由(you)于(yu)客戶在(zai)(zai)進(jin)行(xing)PCR反(fan)(fan)應(ying)時，在(zai)(zai)反(fan)(fan)應(ying)體系(xi)中加入(ru)的(de)(de)(de)(de)鹽(yan)(yan)離(li)(li)子(zi)濃(nong)(nong)度(du)過高。鹽(yan)(yan)離(li)(li)子(zi)的(de)(de)(de)(de)來源有(you)PCR反(fan)(fan)應(ying)體系(xi)中的(de)(de)(de)(de)緩沖液(ye)即buffer，有(you)些情況下是由(you)單獨(du)加入(ru)的(de)(de)(de)(de)鎂離(li)(li)子(zi)造成的(de)(de)(de)(de)。對于(yu)這種樣品，通(tong)過電泳檢測(ce)是不能對其進(jin)行(xing)區分(fen)的(de)(de)(de)(de)，只(zhi)有(you)在(zai)(zai)測(ce)序結果出來后分(fen)析峰(feng)(feng)圖才可能發(fa)現問(wen)題所在(zai)(zai)，典型(xing)的(de)(de)(de)(de)峰(feng)(feng)圖表現為前(qian)70-80甚(shen)至100個堿基的(de)(de)(de)(de)峰(feng)(feng)型(xing)基線漂離(li)(li)，嚴(yan)重影(ying)響(xiang)測(ce)序結果前(qian)面(mian)部分(fen)的(de)(de)(de)(de)準確性。由(you)于(yu)通(tong)過純(chun)化的(de)(de)(de)(de)方(fang)法只(zhi)能部分(fen)的(de)(de)(de)(de)去除(chu)少量(liang)鹽(yan)(yan)分(fen)，無法解決鹽(yan)(yan)離(li)(li)子(zi)對測(ce)序結果的(de)(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)。